| 体外研究 |
5-硝基BAPTA,设计用于细胞质Ca2+的红色荧光探针,在长波长区域具有强发射[1]。培养的Hela细胞荧光成像的一般程序[1]：1.将细胞置于35 mm多聚赖氨酸涂层玻璃底培养皿(Matsunami)中,DMEM中添加10%(v/v)胎牛血清、1%青霉素和1%链霉素。2.取出DMEM,用HBSS清洗盘子3次,然后将CaTM-2 AM(3μM)添加到含有0.3%DMSO作为助溶剂的Hanks平衡盐溶液(HBSS)中。3.37°C孵育30分钟,取出培养基,用HBSS洗碗3次。在HBSS中可以观察到细胞。4.捕获激发和发射波长为590/610-680 nm的荧光图像。切片荧光成像的一般程序[1]：1.用2mL染料溶液在37ºC下培养玻片培养40分钟。染料溶液为含有10μM CaTM-2 AM、0.01%Pluronic F-127和0.005%Cremophor EL的人工脑脊液(aCSF)。aCSF由：126 mM NaCl、26 mM NaHCO3、3.5 mM KCl、1.24 mM NaH2PO4、1.3 mM MgSO4、1.2 mM CaCl2和10葡萄糖组成。2.用aCSF清洗切片三次,并在37ºC下于2 mL aCSF中恢复45分钟,在此期间,在40分钟时向aCSF添加2µL 1 mM吖啶橙。3.将切片培养物转移到35ºC加热的记录室中,并以2 mL/min的速度连续灌注aCSF。4.使用Nipkowdisk共焦装置(CSUX-1,横河电机,日本东京)、冷却CCD相机(iXon DU897,安多,贝尔法斯特,英国)、浸水物镜(16×,0.NA,日本东京,尼康)和图像采集软件(索利斯,安多科技,英国贝尔法斯特)以10帧/秒的速度采集图像。5.使用氩氪激光器(641-YB-A01；Melles-Griot,Carlsbad,CA,USA)将吖啶橙和CaTM-2的激发波长设置为488 nm(7 mW)和568 nm(15 mW),并将发射波长分别设置为520-535 nm和617-673 nm带通发射滤波器。6.使用Microsoft Visual Basic编写的定制软件分析数据。7.将荧光变化ΔF/F计算为(Ft-F0)/F0,其中Ft是帧时间t的荧光强度,F0是平均基线。
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