卡博替尼_作用_生物活性_靶点活性

卡博替尼是一种口服生物可利用的小分子受体酪氨酸激酶（RTK）抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。那么它的生物活性是什么？如何做实验呢？下面让小编给您详细说明。

首先我们介绍卡博替尼的生物活性：

1）体外活性
卡博替尼是MET和VEGFR2的有效抑制剂，IC50值分别为1.3和0.035nM。卡博替尼也抑制MET活化激酶结构域突变Y1248H，D1246N或K1262R（分别为IC50=3.8,1.18和14.6nM）。卡博替尼显示出对几种激酶的强烈抑制作用，这些激酶也与肿瘤病理学有关，包括KIT，RET，AXL，TIE2和FLT3（分别为IC50=4.6,5.2,7,14.3和11.3nM）。

在细胞试验中，卡博替尼抑制MET和VEGFR2以及KIT，FLT3和AXL的磷酸化，IC5​​0值分别为7.8,1.9,5.0,7.5和42μM。在许多人肿瘤细胞系中评估了卡博替尼对增殖的作用。携带扩增MET的SNU-5和Hs746T细胞对卡博替尼最敏感（IC50分别为19和9.9nM）;然而，缺乏MET扩增的SNU-1和SNU-16细胞更具抗性（IC50分别为5,223和1,149nM）。MDA-MB-231和U87MG细胞对卡博替尼的敏感性水平相当（IC50分别为6,421和1,851nM），而H441，H69和PC3细胞系对卡博替尼最不敏感，IC50值为21,700,20,200，分别为10,800nM。此外，与野生型BaF3细胞（IC50=9,641nM）相比，表达人FLT3-ITD（急性髓性白血病中的活化突变）的BaF3细胞对卡博替尼敏感（IC50=15nM）[2]。

2）体内活性
卡博替尼（XL184）后肿瘤血管分布减少，3mg/kg时减少67％，30mg/kg时减少83％[1]。在小鼠模型中，卡博替尼显着改变肿瘤病理学，导致肿瘤和内皮细胞增殖减少，同时增加细胞凋亡和乳腺癌，肺癌和胶质瘤肿瘤模型中肿瘤生长的剂量依赖性抑制。重要的是，用卡博替尼治疗不会增加转移实验模型中的肺肿瘤负荷，已经观察到VEGF信号传导抑制剂不靶向MET。基于体重剂量，卡博替尼血浆暴露在大鼠中比在小鼠中高6至10倍，这导致在大鼠中诱导肿瘤生长抑制/消退的较低剂量比在小鼠中小。卡博替尼的亚慢性给药在小鼠和大鼠中具有良好的耐受性，没有毒性迹象，这通过在治疗期间稳定和/或增加体重来确定[2]。

我们已经了解了卡博替尼的生物活性，接下来如何做活性实验呢？一般来说，有如下的三种方法：

1）动物实验
小鼠[1]-使用C57BL/6背景中的RIP-Tag2小鼠作为肿瘤模型。除非另有说明，否则RIP-Tag2小鼠在治疗开始时为10周龄。将卡博替尼以5mg/mL的浓度悬浮于无菌盐水或水中，并通过管饲法每天施用7天。每天通过强饲法治疗7天的小鼠研究剂量依赖性效应：XL880（1,10,20,40或60mg/kg），卡博替尼（3,10,30,40或60mg/kg）或XL999（25,40,50,60或75mg/kg）。在用XL880（40mg/kg）处理6小时，1,4,7或14天的小鼠中研究作用的时间过程。在用XL880（40mg/kg）处理7天的小鼠中研究戒断的影响，然后在0天，2天，7天或14天不进行治疗。每组含有4-6只小鼠。

小鼠[2]-使用雌性nu/nu小鼠。将H441细胞（3×106）皮内植入后胁腹，当肿瘤达到约150mg时，使用下式计算肿瘤重量:(肿瘤体积=长度（mm）×宽度2（mm2）]/2，小鼠随机分组（每组n=5）并口服单次100mg/kg剂量的卡博替尼或载体。在指定的时间点收集肿瘤。合并的肿瘤裂解物用抗MET进行免疫沉淀，并用抗磷酸酪氨酸MET进行Western印迹。在印迹剥离后，将总MET定量为加样对照。

大鼠[2]-在雌性Wistar大鼠的第0天，将C6细胞（5×106）皮下接种到后胁腹中。当肿瘤达到约250mg（植入后3-4天）时，将大鼠随机化（每组n=8）并用卡博替尼或水载体每天口服一次，持续12天。卡博替尼通过口服强饲法以2mL/kg给药。每天收集体重，每周收集两次肿瘤重量。肿瘤生长抑制/回归值的百分比表示如下：1-[（平均治疗的肿瘤重量在最后一天-第0天的平均肿瘤重量）/（平均载体肿瘤重量在最后一天-平均肿瘤重量在第0天）]×100。通过单向ANOVA进行卡博替尼处理的肿瘤与媒介物处理的肿瘤或与给药前肿瘤相比的统计学分析，其显着性定义为P<0.05。在最终剂量后4小时收集血液，并制备血浆以确定卡博替尼的浓度。

2）细胞实验
在许多人肿瘤细胞系中评估了卡博替尼对增殖的影响，包括含有扩增的MET，SNU-1和SNU-16细胞的SNU-5和Hs746T细胞，MDA-MB-231和U87MG细胞，H441，H69，和PC3细胞系，以及BaF3细胞。将细胞在含有10％FBS的培养基中一式三份接种过夜。第二天，用连续稀释的卡博替尼处理细胞48小时，然后使用CellProliferationELISA，BrdUrd分析增殖[2]。

3）激酶实验
使用荧光素酶偶联的化学发光，33P-磷酰基转移或AlphaScreen技术测定卡博替尼对270种人激酶的广泛组的抑制特性。使用重组人全长，谷胱甘肽S-转移酶标签或组氨酸标签融合蛋白，并且通过测量每种相应激酶在Km或低于Km的ATP浓度下肽底物聚（Glu，Tyr）的磷酸化来确定IC50值。通过测定ATP浓度范围内的IC50值，使用AlphaScreenAssay评估激酶抑制的机制[2]。

今天介绍了卡博替尼的作用，并且详细地说明了它的生物活性和实验方法。综上所述，卡博替尼是一种有效的多受体酪氨酸激酶抑制剂，抑制VEGFR2，c-Met，Kit，Axl和Flt3的IC50分别为0.035，1.3，4.6，7和11.3nM。卡博替尼的靶点活性为AXL,7.0nM；c-Met,1.3nM；Kit,4.6nM；VEGFR2/KDR,0.035nM；VEGFR3/FLT4,6.0nM。

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参考文献：
[1]. You WK, et al. VEGF and c-Met blockade amplify angiogenesis inhibition in pancreatic islet cancer. Cancer Res, 2011, 71(14), 4758-4768.
[2]. Yakes FM, et al. Cabozantinib (XL184), a novel MET and VEGFR2 inhibitor, simultaneously suppresses metastasis, angiogenesis, and tumor growth. Mol Cancer Ther, 2011, 10(12), 2298-2308.
[3]. Fuse MA, et al. Combination Therapy With c-Met and Src Inhibitors Induces Caspase-Dependent Apoptosis of Merlin-Deficient Schwann Cells and Suppresses Growth of Schwannoma Cells. Mol Cancer Ther. Mol Cancer Ther. 2017 Nov;16(11):2387-2398.