维罗非尼-作用-生物活性-靶点活性

维罗非尼（PLX4032，RG7204）是一种新型有效的B-RafV600E抑制剂（IC50为31nM，无细胞试验）。它选择性结合BRAF（V600E）激酶的ATP结合位点并抑制其活性，这可能导致BRAF（V600E）激酶表达肿瘤细胞下游过度激活的MAPK信号通路的抑制和肿瘤的减少细胞增殖。那么它的生物活性是什么？如何做实验呢？下面让小编给您详细说明。

首先我们介绍维罗非尼的生物活性：

1）体外活性
维罗非尼（PLX4032）选择性阻断BRAF突变细胞中的RAF/MEK/ERK途径[1]。RG7204是在17种黑素瘤细胞系中表达RAFV600E而非BRAFWT的那些中有效的增殖抑制剂。维罗非尼（RG7204）在CHL-1细胞中诱导高浓度的MEK和ERK磷酸化[2]。

维罗非尼（PLX4032）（0.1-30μM）对MEK1/2和ERK1/2的磷酸化有抑制作用。PLX4032抑制B-RAFV600E（IC50：31nM），C-RAF（IC50：48nM）和野生型B-RAF（IC50：100nM）。PLX4032还抑制一些非-RAF激酶，包括ACK1，KHS1和SRMS（IC50：18-51nM）。在结肠癌细胞中，PLX4032对B-RAFV600E的抑制作用造成表皮生长因子受体激活的快速回应，可用于补偿PLX4032对细胞增殖的抑制作用。

PLX4032对MALME-3M，Colo829，Colo38，A375，SK-MEL28和A2058细胞具有抑制作用（IC50：20-1μM）。PLX4032对黑色素瘤细胞系的抑制效果依赖于B-RAF的突变状态，因为PLX4032有效抑制含B-RAFV600突变的细胞，包括V600E/D/K/R，但对野生型或其他突变没有作用效果。

2）体内活性
维罗非尼（PLX4032,20,25,75mg/kg，p.o。）引起肿瘤生长的剂量依赖性抑制，较高的暴露导致BRAF突变异种移植物的肿瘤消退[1]。RG7204（12.5,25和75mg/kg，口服）在携带LOX肿瘤异种移植物的小鼠中显着抑制肿瘤生长并诱导肿瘤消退[2]。

我们已经了解了维罗非尼的生物活性，接下来如何做活性实验呢？一般来说，有如下的三种方法：

1）动物实验
无胸腺裸鼠，年龄为13至14周，体重约23至25克。对于LOX异种移植物，皮下注射0.2mLPBS中的2×106个细胞。进入右侧翼。将配制成MBP的维罗非尼（RG7204）在含有2％KlucelLF的含水载体中按需要悬浮于所需浓度，并用稀HCl调节至pH4。替莫唑胺含有250毫克胶囊。打开胶囊并将其组合成一个批量供应。为了制备原料投配材料，首先将替莫唑胺溶于100％DMSO中，然后用盐水稀释，在10％DMSO/90％盐水（pH3.4）中形成最终的乳白色悬浮液。

2）细胞实验
通过MTT测定评估细胞增殖。简言之，将细胞以每孔1000至5000个细胞的密度接种于96孔微量滴定板中，体积为180μL。PLX4032在含有1％DMSO的培养基中以最终测定浓度的10倍制备。在细胞铺板后24小时，将20μL适当稀释的PLX4032一式两份加入板中。在细胞铺板后6天测定平板的增殖。计算抑制百分比，并通过浓度的对数对抑制百分比的曲线的回归确定IC50。

3）激酶实验
RAF激酶活性测量：野生型RAF和突变体的激酶活性通过测量生物素化的BAD蛋白的磷酸化来确定。对于每种酶（0.01ng），在20mMHepes（pH7.0），10mMMgCl2,1mMDTT，0.01％（v/v）Tween-20,50nM生物素-BAD蛋白质中进行20μL反应，并且室温下1mMATP。用5μL含有20mMHepes（pH7.0），200mMNaCl，80mMEDTA，0.3％（w/v）牛血清白蛋白（BSA）的溶液在5分钟时停止反应。终止溶液还包括磷酸-BAD（Ser112）抗体，链霉抗生物素蛋白包被的供体珠和蛋白A受体珠。将抗体和珠子在室温下在黑暗中在终止溶液中预温育30分钟。抗体的最终稀释度为1/2000，每个珠子的最终浓度为10μg/mL。将测定板在室温下温育1小时，然后在PerkinElmerAlphaQuest读数器上读数。突变活性是在三个不同实验中一式两份测定的两批不同批次的纯化蛋白的平均值。

今天介绍了维罗非尼的作用，并且详细地说明了它的生物活性和实验方法。综上所述，维罗非尼维罗非尼是有效的B-RAF抑制剂，能够抑制RAFV600E和c-RAF-1的活性，IC50分别为31nM和48nM。维罗非尼的靶点活性为ACK1,19nM；BLK,547nM；B-Raf,100nM；B-Raf(V600E),31nM；BRK,213nM；C-Raf,48nM；CSK,2.339μM；FGR,63nM；FRK(PTK5),1.884μM；Lck,183nM；LynB,599nM；MAP4K5(KHS1),51nM；MNK2,1.717μM；NEK11,317nM；Src,2.389μM；SRMS,18nM；WNK3,877nM；Yes1,604nM。

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参考文献：
[1]. Bollag G, et al. Clinical efficacy of a RAF inhibitor needs broad target blockade in BRAF-mutant melanoma. Nature, 2010, 467(7315), 596-599.
[2]. Yang H, et al. RG7204 (PLX4032), a selective BRAFV600E inhibitor, displays potent antitumor activity in preclinical melanoma models. Cancer Res, 2010, 70(13), 5518-5527.
[3]. Prahallad A, et al. Unresponsiveness of colon cancer to BRAF(V600E) inhibition through feedback activation of EGFR. Nature, 2012, 483(7387), 100-103.