枸橼酸托法替尼-作用-生物活性-靶点活性

枸橼酸托法替尼（CP-690550柠檬酸盐）是一种新型JAK3抑制剂（IC50：1nM），对JAK2/1的效力低20至100倍。那么它的生物活性是什么？如何做实验呢？下面让小编给您详细说明。

首先我们介绍枸橼酸托法替尼的生物活性：

1）体外活性
枸橼酸托法替尼可能在JAK3和JAK2处结合为2.2nM和5nM（Kd）。该报告包括在Camk1（Kd为5,000nM），DCamkL3（Kd为4.5nM），Mst2（Kd为4,300nM），Pkn1（Kd为200nM），Rps6ka2（Kin.Dom.2-C-）的托法替尼的额外结合（Kd为1,400nM），Rps6ka6（Kin.Dom.2-C-末端）（Kd为1,200nM），Snark（Kd为420nM），Tnk1（Kd为640nM）和Tyk2（Kd为620nM））[1]。

将K562，KCL22和THP-1细胞暴露于不同剂量的伊马替尼（IMA）或JAK抑制剂72小时以量化酪氨酸激酶抑制剂（TKI）活性的作用。然后使用MTT测定评估细胞生长抑制。IMA以浓度依赖性方式抑制K562和KCL22细胞的增殖，但不抑制THP-1细胞的增殖。K562的IMA的IC50值为0.28μM，KCL22的IC50值为0.17μM。尽管单独用托法替尼（TOF）或鲁索利替尼（RUX）治疗不能抑制细胞增殖，但托法替尼和鲁索利替尼均使K562和KCL22对IMA更敏感[4]。

2）体内活性
在小鼠模型中，枸橼酸托法替尼降低延迟型超敏反应和延长心脏同种异体移植物存活。此外，枸橼酸托法替尼处理来自JAK2V617F阳性PV患者的体外扩增的红细胞祖细胞导致特异性，抗增殖（IC50=0.2μM）和促凋亡活性。相反，来自健康对照的扩增祖细胞对枸橼酸托法替尼的增殖（IC50>1.0μM）和细胞凋亡检测不太敏感[2]。

在10和30mg/kg/天给予枸橼酸托法替尼2周期间，观察到相对于载体治疗的NK细胞数量的显着的，时间依赖性的降低。枸橼酸托法替尼治疗组的效应记忆CD8+细胞数比用载体治疗的动物中观察到的少55％[3]。

我们已经了解了枸橼酸托法替尼的生物活性，接下来如何做活性实验呢？一般来说，有如下的三种方法：

1）动物实验
小鼠[2]-使用雌性BALB/c小鼠（6-8周龄）。小鼠通过渗透泵输注（0.25μL/小时，28天）在PEG300（100mg/mL）或单独的载体（PEG300）中接受托法替尼。免疫前4天，将小鼠麻醉并剃除其背部表面。在背部做一厘米的切口以形成皮下袋并插入泵。切口部位用伤口夹闭合。从第0天开始每周（i.p.）注射SS1P重组免疫毒素（RIT;5μg/小鼠）;对照小鼠仅接受盐水注射。在SS1P或载体免疫前每周，抽取50μL血液以获得血清样品。将血清储存在-80℃直至分析。

大鼠[3]-在雌性Lewis大鼠中诱导佐剂诱导的关节炎（AIA）。根据后爪体积随机分配大鼠并将其分配给托法替尼或载体治疗方案。每个治疗组7-8只大鼠组和正常幼稚大鼠（每组n=4）在开始治疗后4小时，4天或7天安乐死（分别在免疫后第16,20和23天）。在免疫接种后第16天开始每日口服给予载体或托法替尼（6.2mg/kg）并持续至第23天。在治疗开始后4天和7天（分别在免疫后第20天和第23天）重新评估爪体积。）。对于微型计算机断层扫描（micro-CT）成像，以及爪组织中的抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色，在单独的Lewis大鼠队列中诱导AIA。

2）细胞实验
使用相同的培养条件对FDCP-EpoRJAK2WT和JAK2V617F细胞系进行柠檬酸托法替尼对生长抑制的测定。简言之，使用补充有1.25％FCS和5％WEHI上清液的RPMI1640，在37℃，湿润的5％ CO2气氛中，在96孔平底板中培养1×105个细胞/mL。降低FCS浓度对于防止柠檬酸托法替尼与血清蛋白之间的结合是必要的。通过添加20μL CellTiter96 One Solution Reagent终止生长抑制测定。将平底板再孵育3小时用于MTT测定。在BioTek Synergy-HT酶标仪上测定595nm处的吸光度。结果是三次独立测定的平均标准偏差。

3）激酶实验
JAK1，JAK2和JAK3激酶测定利用在谷胱甘肽-琼脂糖凝胶上通过亲和层析纯化的杆状病毒感染的SF9细胞（GST的融合蛋白和人JAK酶的催化结构域）中表达的蛋白质。用于反应的底物是聚谷氨酸-酪氨酸[PGT（4：1）]，在37℃下以100μg/mL涂覆在NuncMaxiSorp板上过夜。将板洗涤三次，并向孔中加入JAK酶，其中含有100μL激酶缓冲液（50m MHEPES，pH7.3,125 mM NaCl，24 mM MgCl2）+ATP+1 mM原钒酸钠）。对于柠檬酸托法替尼，它也被添加用于不同剂量的激酶测定。在室温下孵育30分钟后，将板洗涤三次。通过使用抗磷酸酪氨酸抗体的标准ELISA测定法测定给定孔中磷酸化酪氨酸的水平。

今天介绍了枸橼酸托法替尼的作用，并且详细地说明了它的生物活性和实验方法。综上所述，枸橼酸托法替尼是JAK1/2/3抑制剂，IC50分别为1，20和112nM。枸橼酸托法替尼的靶点活性为JAK1,112nM；JAK2,20nM；JAK3,1nM；Lck,3.87μM；ROCK2,3.4μM。

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参考文献：
[1]. Jiang JK, et al. Examining the chirality, conformation and selective kinase inhibition of 3-((3R,4R)-4-methyl-3-(methyl(7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl)amino)piperidin-1-yl)-3-oxopropanenitrile (CP-690,550). J Med Chem. 2008 Dec 25;51(24):8012-8.
[2]. Onda M, et al. Tofacitinib suppresses antibody responses to protein therapeutics in murine hosts. J Immunol. 2014 Jul 1;193(1):48-55.
[3]. LaBranche TP, et al. JAK inhibition with tofacitinib suppresses arthritic joint structural damage through decreased RANKL production. Arthritis Rheum. 2012 Nov;64(11):3531-42.
[4]. Yagi K, et al. Pharmacological inhibition of JAK3 enhances the antitumor activity of imatinib in human chronic myeloid leukemia. Eur J Pharmacol. 2018 Apr 15;825:28-33.