法舒地尔的作用 - 生物活性 - 靶点活性

法舒地尔，英文名Fasudil，CAS号是103745-39-7，它是一种有效的ROCK1，PKA，PKC和MLCK的抑制剂，Ki值分别为0.33μM，1.0μM，9.3μM和55μM。那么它的生物活性是什么？如何做实验呢？下面让小编给您详细说明。

首先我们介绍法舒地尔的生物活性：

1）体外活性
法舒地尔具有血管舒张作用，占据酶结合位点的腺嘌呤口袋[1]。法舒地尔对去极化兔主动脉的Ca2+诱导的收缩产生竞争性抑制作用。法舒地尔抑制对KCl，苯乙烯（PHE）和前列腺素（PG）F2a的收缩反应[2]。法舒地尔还通过抑制5-羟色胺，去甲肾上腺素，组胺，血管紧张素和多巴胺诱导的螺旋条带收缩而表现出血管扩张作用[3]。

此外，法舒地尔诱导肌动蛋白应力纤维的解体和细胞迁移抑制[4]。法舒地尔抑制肝星状细胞扩散，应激纤维的形成和α-SMA的表达，同时抑制细胞生长，但不诱导细胞凋亡。法舒地尔还阻断了LPA诱导的ERK1/2，JNK和p38MAPK的磷酸化[5]。

2）体内活性
法舒地尔（30μg）通过冠状动脉内注射给狗增加了50％的CBF。法舒地尔（0.01,0.03,0.1和0.3mg/kg，推注，静脉注射）降低MBP并增加HR，VBF，CBF，RBF和FBF。法舒地尔（1.0ng/mL）可增加心输出量。它通过i.v.随着HR和心输出量的增加，MBP，左心室收缩压和总外周阻力显着下降，但对犬右心房压，dP/dt或左心室分钟功无明显影响[3]。

法舒地尔对心血管疾病具有可保护作用，可减少JNK的激活，减轻缺血性损伤后AIF的线粒体-核转位[6]。法舒地尔（100mg/kg/天，口服）显着降低用PLPp139-151免疫的SJL/J小鼠中EAE的发生率和平均最大临床评分。法舒地尔抑制脾细胞对小鼠抗原的增殖反应。法舒地尔通过p.o.减少法舒地尔治疗小鼠的炎症，脱髓鞘，轴突丧失和脊髓APP阳性。

我们已经了解了法舒地尔的生物活性，接下来如何做激酶实验呢？

在含有最终体积为0.2mL的50mMTris-HCl（pH7.0），10mM乙酸镁，2mMEGTA，1μM环AMP或不含环状的反应混合物中测定环AMP依赖性蛋白激酶活性。AMP，3.3至20μM[r-32P]ATP（4×105cpm），0.5μg酶，100μg组蛋白H2B和化合物。将混合物在30℃下孵育5分钟。加入500μg牛血清白蛋白作为载体蛋白后，加入1mL冰冷的20％三氯乙酸终止反应。

将样品在3000转/分下离心。保持15分钟，将沉淀重悬于冰冷的10％三氯乙酸溶液中，并重复离心-再悬浮循环三次。将最终的沉淀溶解在1mL的1NNaOH中，并用液体闪烁计数器[1]测量放射性。

今天介绍了法舒地尔的作用，并且详细地说明了它的生物活性和激酶实验方法。综上所述，法舒地尔是ROCK1，PKA，PKC和MLCK的有效抑制剂。它的靶点活性是MLCK,36μM；PKA,1.6μM；PKC,3.3μM；PKG,1.6μM；ROCK2,0.33μM(Ki)。

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参考文献：
[1]. Ono-Saito N, et al. H-series protein kinase inhibitors and potential clinical applications. Pharmacol Ther. 1999 May-Jun;82(2-3):123-31.
[2]. Asano T, et al. Mechanism of action of a novel antivasospasm drug, HA1077. J Pharmacol Exp Ther. 1987 Jun;241(3):1033-40.
[3]. Asano T, et al. Vasodilator actions of HA1077 in vitro and in vivo putatively mediated by the inhibition of protein kinase. Br J Pharmacol. 1989 Dec;98(4):1091-100.
[4]. Negoro N, et al. The kinase inhibitor fasudil (HA-1077) reduces intimal hyperplasia through inhibiting migration and enhancing cell loss of vascular smooth muscle cells. Biochem Biophys Res Commun. 1999 Aug 19;262(1):211-5.
[5]. Fukushima M, et al. Fasudil hydrochloride hydrate, a Rho-kinase (ROCK) inhibitor, suppresses collagen production and enhances collagenase activity in hepatic stellate cells. Liver Int. 2005 Aug;25(4):829-38.
[6]. Zhang J, et al. Inhibition of the activity of Rho-kinase reduces cardiomyocyte apoptosis in heart ischemia/reperfusion via suppressing JNK-mediated AIF translocation. Clin Chim Acta. 2009 Mar;401(1-2):76-80.
[7]. Sun X, et al. The selective Rho-kinase inhibitor Fasudil is protective and therapeutic in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmunol. 2006 Nov;180(1-2):126-34.
[8]. Uehata M, et al. Calcium sensitization of smooth muscle mediated by a Rho-associated protein kinase in hypertension. Nature. 1997 Oct 30;389(6654):990-4.