夫拉平度的作用 - 生物活性 - 靶点活性

夫拉平度，英文名Flavopiridol，CAS号是146426-40-6，它与ATP竞争抑制CDK，包括CDK1，CDK2，CDK4和CDK6，IC50为~40 nM。它对CDK1的选择性是7.5倍，相对于CDK7是2,4,6。最初发现夫拉平度抑制EGFR和PKA， 阶段1/2。那么它的生物活性是什么？如何做实验呢？下面让小编给您详细说明。

首先我们介绍夫拉平度的生物活性：

1）体外活性
夫拉平度对不相关的激酶如MAP，PAK，PKC和EGFR的活性较低，IC50>14μM。夫拉平度显着抑制HCT116，A2780，PC3和Mia PaCa-2细胞的集落生长，IC50分别为13 nM，15 nM，10 nM和36 nM。[1]

夫拉平度还有效抑制糖原合成酶激酶-3（GSK-3）的活性，IC50为280 nm。[2]与其他CDK相比，夫拉平度抑制CDK7的活性较低，IC50为875 nM。夫拉平度（0.5μM）抑制pSer807 / 811 Rb和pThr199 NPM，而在pThr821 Rb时观察到轻微变化。夫拉平度还降低了整体RNA聚合酶II水平，以及在Ser2 Ser5的CTD重复上RNA聚合酶II的磷酸化。[3]

作为广谱CDK抑制剂，夫拉平度可以抑制G1或G2中的细胞周期进展。通过抑制CDK4或CDK2激酶活性，夫拉平度（0.3μM）在MCF-7或MDA-MB-468细胞中诱导G1停滞。[4] 夫拉平度对多种肿瘤细胞系表现出强大的细胞毒性，IC50值范围为LNCAP的16 nM至K562的130 nM。[5]

2）体内活性
以7.5mg / kg施用夫拉平度 7天显示出对P388鼠白血病的轻微抗肿瘤活性，导致％T / C值为110，并且对裸鼠中植入sc的人A2780卵巢癌具有活性，产生1.5log细胞杀伤（LCK）。[5] 夫拉平度以1-2.5 mg / kg治疗10天，通过抑制滑膜增生和关节破坏，以剂量依赖的方式显着抑制小鼠胶原诱导的关节炎，而血清浓度为II型抗原胶原（CII） 保持对CII的Abs和增殖反应。[6]

在裸鼠的p21-完整Hct116异种移植物中，给予CPT-11（100mg / kg），然后给予夫拉平度（3mg / kg）7和16小时后显着抑制肿瘤消退86％和82％， 与单独使用CPT-11相比，显示出> 2倍的抑制率，为40％。与单独的CPT-11相比，该组合产生约30％的完全响应率（CR），其中未发现CR。[7]

我们已经了解了夫拉平度的生物活性，接下来如何做活性实验呢？具体有如下三种实验方法：

1）动物实验
动物实验：用P388腹水白血病细胞腹膜内接种FeBalb / c×DBA / 2J F1小鼠，皮下植入A2780，Br-cycE或A431细胞的Balb / c nu / nu裸鼠。

2）细胞实验
将细胞暴露于各种浓度的夫拉平度 72小时，此时加入四唑鎓染料MTS与吩嗪硫酸甲酯的组合。3小时后，在492nm处测量吸光度，其与活细胞的数量成比例。结果表示为IC 50值。对于细胞周期分析，将细胞在多聚甲醛和乙醇中固定，洗涤，重悬浮于TdT酶和FITC-dUTP的染色溶液中，洗涤，在RNA酶处理后用PI染色，然后通过流式细胞术分析。

3）激酶实验
CDK激酶测定：对于CDK1 /细胞周期蛋白B1激酶测定，激酶反应由100ng杆状病毒表达的GST-CDK1 /细胞周期蛋白B1（人）复合物，1μg组蛋白HI，0.2μCi[γ-33P] ATP，25μMATP组成。50μL激酶缓冲液（50mM Tris，pH 8.0,10mM MgCl 2,1mM EGTA，0.5mM DTT）。

对于CDK2 /细胞周期蛋白E激酶测定，激酶反应由5ng杆状病毒表达的GST-CDK2 /细胞周期蛋白E（人）复合物，0.5μgGST-RB融合蛋白（视网膜母细胞瘤蛋白的氨基酸776-928），0.2μCi[γ]组成。-33P]在50μL激酶缓冲液（50mM Hepes，pH 8.0,10mM MgCl 2,1mM EGTA，2mM DTT）中的ATP，25μMATP。

对于CDK4 /细胞周期蛋白D1激酶测定，激酶反应由150ng杆状病毒表达的GST-CDK4 /细胞周期蛋白D1（人），280ng Stag-细胞周期蛋白D1,0.5μgGST-RB融合蛋白（视网膜母细胞瘤的氨基酸776-928）组成。蛋白质），0.2μCi[γ-33P] ATP，50μL激酶缓冲液（50mM Hepes，pH 8.0,10mM MgCl 2,1mM EGTA，2mM DTT）中的25μMATP。

对于CDK1和CDK2，反应温育45分钟，或者在30℃温育CDK4 1小时，并通过加入冷的三氯乙酸（TCA）终止至终浓度15％。使用Filtermate通用收集器将TCA沉淀物收集到GF / C unifilter板上，并使用TopCount 96孔液体闪烁计数器对过滤器进行定量。将夫拉平度以10mM溶于二甲基甲酰胺（DMF）中，并以六种浓度评价，每种浓度一式三份。测定中DMF的最终浓度= 2％。IC50值通过非线性回归分析得出，方差系数= 16％。为了测定对CDK6的夫拉平度活性，建立了过滤结合测定。

将以下物质合并在反应混合物中：2μLCDK6（0.7 mg /μL），5μL组蛋白H1（6 mg / mL），14μL激酶缓冲液（60mMβ-甘油磷酸盐，30 mM对硝基苯磷酸盐） ，25 mM MOPS（pH 7.0），5 mM EGTA，15 mM MgCl 2,1 mM DTT，0.1 mM钒酸钠），3μL浓度增加浓度的夫拉平度稀释于50％DMSO中，和6μL33P-ATP（1 mCi / mL）在90μM浓度的非放射性ATP中（终浓度：15μM）。通过添加33P-ATP启动测定。将反应在30℃下温育20分钟。然后将25μL上清液的等分试样点在Whatman P81磷酸纤维素纸上。用1％磷酸溶液洗涤滤器5次。

在1mL闪烁液的存在下计数湿滤器。使用50mM HEPES pH 7.5,10mM MgCl 2,1mM DTT，3μMNa3 VO4,150μMRNA聚合酶CDT肽和80μMATP中的50nM重组Cdk9 /细胞周期蛋白T测量Cdk9活性。在200μMATP和10μM髓鞘结合蛋白作为底物的存在下，使用37nM纯化的激酶在相同的缓冲液中进行Cdk7测定。使用强阴离子交换剂（Dowex 1-X8树脂，甲酸盐形式）测定或闪烁亲近测定法测定夫拉平度对CDK9和CDK7的效力。从剂量 - 反应曲线计算IC 50值。

今天介绍了夫拉平度的作用，并且详细地说明了它具体的生物实验方法。综上所述，夫拉平度Flavopiridol是一种竞争型的 CDK 广谱抑制剂， 抑制CDK1，CDK2，CDK4的IC50 分别为30，170，100 nM。它的靶点活性是CDK1,40nM；CDK2,40nM；CDK4,40nM；CDK6,40nM；CDK7,300nM。

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参考文献：
1. Kim KS, et al. J Med Chem, 2000, 43(22), 4126-4134.
2. Lu H, et al. J Med Chem, 2005, 48(3), 737-743.
3. Montagnoli A, et al. Nat Chem Biol, 2008, 4(6), 357-365.
4. Carlson BA, et al. Cancer Res, 1996, 56(13), 2973-2978.
5. Kim KS, et al. J Med Chem, 2002, 45(18), 3905-3927.
6. Sekine C, et al. J Immunol, 2008, 180(3), 1954-1961.
7. Motwani M, et al. Clin Cancer Res, 2001, 7(12), 4209-4219.