PHA-848125的作用 - 生物活性 - 靶点活性

PHA-848125，别名Milciclib，CAS号是802539-81-7，它是一种有效的ATP竞争性CDK抑制剂CDK2，IC50为45 nM。CDK2的选择性比CDK1,2,4,5和7高3倍。那么它的生物活性是什么？如何做实验呢？下面让小编给您详细说明。

首先我们介绍PHA-848125的生物活性：

1）体外活性
尽管具有较低的效力，PHA-848125抑制细胞周期蛋白H / CDK7，细胞周期蛋白D1 / CDK4，p35 / CDK5以及细胞周期蛋白E / CDK2和细胞周期蛋白B / CDK1的活性，IC50值为0.15,0.16,0.265,0.363 ，分别为0.398μM。[1] Thropomyosin受体激酶A也被PHA-848125在与CDK相同的纳摩尔范围内抑制。在大多数PHA-848125敏感细胞系中，PHA-848125诱导浓度依赖性G（1）停滞。[2]

PHA-848125还损害视网膜母细胞瘤蛋白在CDK2和CDK4特异性位点的磷酸化，降低视网膜母细胞瘤蛋白和细胞周期蛋白A水平，并增加p21（Cip1），p27（Kip1）和p53表达。在TMZ后48小时将PHA-848125加入细胞中，并在培养3天后评估细胞生长。[2] TMZ，BG和PHA-848125的药物组合根据细胞系诱导对细胞生长的累加或协同作用。[2]在没有BG的情况下，该组合仍然比对TMZ中度敏感的细胞系中的单一药剂更有活性，但在两种TMZ抗性细胞系中与单独的PHA-848125相当。当TMZ + BG与PHA-848125联合使用时，对抗培养的正常黑素细胞，既没有观察到协同作用，也没有观察到附加的抗增殖作用。[2]

2）体内活性
在临床前异种移植物A2780人卵巢癌模型中，PHA-848125显示出良好的功效并且在重复的每日治疗中具有良好的耐受性。用PHA-848125（40mg / kg，每天两次，持续10天）处理K-Ras（G12D）LA2小鼠，在治疗结束时导致显着的肿瘤生长抑制，并伴随着细胞膜更新的减少。[3]

另一方面，口服给药后，PHA-848125在各种人异种移植物，致癌物诱导的肿瘤和播散性原发性白血病模型中显示出显着的抗肿瘤活性。啮齿动物的血浆浓度与抑制癌细胞增殖的浓度相同。[4]

我们已经了解了PHA-848125的生物活性，接下来如何做活性实验呢？一般来说，有如下的三种方法：

1）细胞实验
将黑素瘤细胞以2×10 4个细胞/ mL的浓度悬浮在培养基中，以50μL等分试样分配到平底96孔板中并使其在37℃下粘附过夜。然后将分级量的PHA-848125或TMZ加入到50μLCM中的孔（每个孔4个孔）中，并将板在37℃，5％CO 2湿润的气氛中温育5天。还结合MGMT抑制剂BG评估TMZ的细胞毒性作用。为此，在TMZ前2小时向板中加入10μMBG，并在整个细胞暴露于药物的整个培养期间离开培养物。

ContS1017rol组由未处理的细胞和仅用BG或DMSO处理的细胞代表。仅用BG或DMSO处理的细胞的生长与未处理细胞的生长没有差异。在加入抑制剂PHA-848125后2小时检测不到BG处理的细胞的MGMT活性，并且直到测定结束时基本上检测不到。将正常黑素细胞以1.6×10 5个细胞/ mL的浓度悬浮于MGM中，接种（50μL/孔）并如针对黑素瘤细胞所述暴露于TMZ + BG或PHA-848125。在孵育期结束时，通过MTT测定评估细胞生长。

简而言之，向每个孔中加入0.1mg MTT（在20μLPBS中），并将细胞在37℃下孵育4小时。然后用含有20％SDS和50％N，N-二甲基甲酰胺，pH4.7的缓冲液（0.1mL /孔）裂解细胞。孵育过夜后，使用3550-UV酶标仪在595nm处读取吸光度。细胞对药物治疗的敏感性以IC50表示（药物浓度产生50％细胞生长抑制，在回归线上计算，其中595nm处的吸光度值相对于药物浓度的对数作图）。

2）动物实验
将大鼠随机化并在至少一个乳腺肿瘤达到0.5cm直径时引入研究。用载体（葡糖苷）或5,10和15mg / kg PHA-848125连续10天每天口服治疗10只动物的组，而另一组接受两个周期的PHA-848125，20mg /天。每天口服两次，持续5天，间隔休息1周。在实验期间通过卡尺定期测量肿瘤体积。

3）激酶实验
生化激酶抑制测定：使用在384孔板上运行的自动化形式的强阴离子交换剂（Dowex 1X8树脂）测定来评估PHA-848125对激酶活性的抑制。在该测定中，使用最佳缓冲液和辅因子，在存在用[γ-33P] ATP追踪的ATP存在下，通过其特异性激酶使特定肽或蛋白质底物转磷酸化。评估PHA-848125对CDK和属于内部激酶选择性筛选组的38种其他激酶的效力，并确定相关的IC 50。对于每种酶，计算ATP和特定底物的绝对KM值，然后在优化的ATP（2KM）和底物（5KM）浓度下进行每个测定。该设置可以直接比较PHA-848125在整个组中的IC50值，以评估其生化特征。

今天介绍了PHA-848125的作用，并且详细地说明了它的生物活性和实验方法。综上所述，PHA-848125（Milciclib）是一种有效的 CDK 和 Tropomyosin receptor kinase (TRK) 双重抑制剂，对 cyclin A/CDK2，cyclin H/CDK7，cyclin D1/CDK4，cyclin E/CDK2，cyclin B/CDK1 和 TRKA 的 IC50 值分别为 45，150，160，363，398 和 53 nM。它的靶点活性是CDK2/CyclinA,45nM；CDK4/CyclinD1,160nM；CDK5/p35,265nM；CDK7/CyclinH,150nM；TrkA,53nM。

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参考文献：
1. Brasca MG, et al. J Med Chem. 2009, 52(16), 5152-5563.
2. Caporali S, et al. Pharmacol Res. 2010, 61(5), 437-448.
3. Degrassi A, et al. Mol Cancer Ther. 2010, 9(3), 673-681.
4. Albanese C, et al. Mol Cancer Ther. 2010, 9(8), 2243-2254.