【MK-1775】- 作用 - 生物活性 - 靶点活性

MK-1775，别名AZD1775或者Adavosertib，它是酪氨酸激酶WEE1的小分子抑制剂（IC50：5.2nM，无细胞试验中）; 阻碍G2 DNA损伤检查点。MK-1775选择性地靶向并抑制WEE1，酪氨酸激酶磷酸化细胞周期蛋白依赖性激酶1（CDK1，CDC2）以使CDC2 /细胞周期蛋白B复合物失活。它的化学中文名是2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙烷-2-基)吡啶-2-基)-6-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基氨基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3(2h)-酮。那么它的生物活性是什么？如何做实验呢？下面让小编给您详细说明。

首先我们介绍MK-1775的生物活性：

1）体外活性
MK-1775增强了5-FU对p53缺陷型人结肠癌细胞的细胞毒作用。MK-1775抑制细胞中CDC2 Y15的磷酸化，消除由5-FU处理诱导的DNA损伤检查点，并通过诱导组蛋白H3磷酸化导致有丝分裂的过早进入[1]。MK-1775在p53缺陷细胞中消除了辐射诱导的G2阻滞，但在p53野生型细胞系中没有[2]。与p53缺陷肿瘤中的吉西他滨治疗相比，吉西他滨与MK-1775的组合产生强大的抗肿瘤活性并显着增强肿瘤消退反应（4.01倍）[3]。

2）体内活性
在体内，MK-1775以可耐受的剂量增强5-FU或其前药卡培他滨的抗肿瘤功效[1]。MK-1775（每天两次60mg / kg，p.o。）增强H1299异种移植肿瘤对分次放疗的反应[2]。与GEM处理的小鼠相比，MK-1775（30mg / kg，p.o。）使PANC198，PANC215和PANC185中的肿瘤生长退化[3]。

我们已经了解了MK-1775的生物活性，接下来如何做活性实验呢？一般来说，有如下的三种方法：

1）细胞实验
使用含有50 mM HEPES（pH 7.9），0.4 mol / L NaCl和1 mM EDTA的裂解液从细胞沉淀中提取总蛋白，并用10μL/ mL磷酸酶抑制剂混合物1,10μL/ mL磷酸酶抑制剂混合物强化 2,10μL/ mL蛋白酶抑制剂和1％NP-40。通过Bio-Rad蛋白质测定法测定裂解物的蛋白质浓度。通过12％SDS-PAGE分离等量的蛋白质并转移至Immobilon膜。

膜上的非特异性结合位点在含有0.1％吐温（TBS-T）的Tris（20mM） - 缓冲盐水（150mM，pH7.4）中的5％脱脂奶粉中封闭。通过将膜在5％脱脂奶粉中的一抗中的膜在4℃温育过夜，然后在合适的过氧化物酶缀合的二抗中孵育45分钟来检测蛋白质信号。然后通过在Typhoon 9400扫描仪上使用ECL加Western Blotting Detection Reagents的增强化学发光来显影膜。

2）动物实验
通过在10μL中接种1×106Calu-6细胞在腿中产生肿瘤异种移植物。当肿瘤直径达到8mm并持续5天时，开始照射和MK-1775治疗。使用由两个平行相对的137Cs源组成的小动物辐照器以5Gy / min的剂量率将γ射线局部递送至未麻醉小鼠的荷瘤腿。每天两次照射肿瘤，间隔6小时。在第一次每日辐射剂量之前1小时和之后2小时，通过管饲法给予MK-1775 0.1mL体积。

3）激酶实验
体外激酶测定：使用重组人Wee1。在增加浓度的MK-1775存在下，在30℃下，用10μMATP，1.0μCi[γ-33P] ATP和2.5μg聚（Lys，Tyr）作为底物进行激酶反应30分钟。将掺入基质中的放射性捕获在MultiScreen-PH板上，并在液体闪烁计数器上计数。

今天介绍了MK-1775的作用，并且详细地说明了它的生物活性和实验方法。综上所述，MK-1775 是一种有效的 Wee1 抑制剂，IC50 值为 5.2 nM。它的靶点活性是Wee1,5.2nM。

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参考文献：
[1]. Hirai H, et al. MK-1775, a small molecule Wee1 inhibitor, enhances anti-tumor efficacy of various DNA-damaging agents, including 5-fluorouracil Cancer Biol Ther. 2010 Apr;9(7):514-22.
[2]. Bridges KA, et al. MK-1775, a novel Wee1 kinase inhibitor, radiosensitizes p53-defective human tumor cells. Clin Cancer Res. 2011 Sep 1;17(17):5638-48. Epub 2011 Jul 28.
[3]. Rajeshkumar NV, et al. MK-1775, a potent Wee1 inhibitor, synergizes with gemcitabine to achieve tumor regressions, selectively in p53-deficient pancreatic cancer xenografts.Clin Cancer Res. 2011 May 1;17(9):2799-806. Epub 2011 Mar 9.