[RGFP 966] - 作用 - 生物活性 - 靶点活性

RGFP966是一种HDAC3抑制剂，在无细胞试验中IC50为0.08μM，比其他HDAC具有> 200倍的选择性。那么它的生物活性是什么？如何做实验呢？下面让小编给您详细说明。

首先我们介绍RGFP966的生物活性：

1）体外活性
RGFP966在RAW 264.7巨噬细胞中有效且选择性地抑制HDAC 3，IC50为0.21μM，而HDAC 1（IC50 =5.6μM），2（9.7μM）和8（>100μM），表明对HDAC 3具有良好的选择性水平。在RAW 264.7巨噬细胞中，HDAC 1,2和3的mRNA水平不受RGFP966的显着影响，而HDAC 1和HDAC 2蛋白水平在RGFP966处理后略微降低，但显着降低。此外，RGFP966显着降低NF-κBp65的转录活性，而NF-κBp65乙酰化和定位保持不变[2]。

2）体内活性
RGFP966（10和25mg/kg）治疗在开放式野外运动试验中显着改善了体重，旋转杆性能和几种运动功能测量[3]。10mg / kg剂量的RGFP966以典型的药代动力学渗透到大脑听觉皮层的血脑屏障，这共同建立了由于听觉皮层中的作用而调节A1可塑性的可行性[4]。

我们已经了解了RGFP966的生物活性，接下来如何做活性实验呢？一般来说，有如下的三种方法：

1）细胞实验
为了研究HDAC3选择性抑制剂RGFP966对细胞活力的影响，将RAW 264.7巨噬细胞，HBE细胞和hASM细胞接种在96孔板中。为了在实验开始时获得相同的细胞密度，将RAW 264.7巨噬细胞以25,000个细胞/ cm 2接种，将HBE细胞和hASM细胞以70％汇合（基于表面积）接种，并在孵育前血清饥饿24小时。与RGFP966。在与RGFP966温育之前不久，将培养基替换为100μL新鲜（如果合适的是无血清）培养基。如通过siRNA对HDAC1-3下调所述进行与LPS和IFNγ的孵育。与RGFP966温育20小时后，向每个孔中加入20μLCellTiter96 AQueous One Solution试剂，并在黑暗中于37℃温育1小时。使用Synergy H1读板仪测量490nm处的吸光度。未添加RGFP966的LPS /IFNγ刺激细胞被认为是100％[2]。

2）动物实验
小鼠[3]-将N171-82Q转基因小鼠圈养并保持在正常的12小时光/暗循环中，在早上6点开灯并自由获取食物和水。从8周龄开始，通过S.C.注射（3次注射/周）给小鼠施用RGFP966（10或25mg / kg）10周。用75％聚乙二醇200/25％乙酸钠（6.25mM）溶解RGFP966; 对照小鼠接受等量的药物载体。体重每周记录两次。在最后一次注射后6小时，通过过量使用异氟烷麻醉处死小鼠18周龄。去除脑，并解剖出纹状体和皮质用于基因表达测定或用4％多聚甲醛心脏内灌注。

大鼠[4]-使用总共三十三只成年雄性Sprague Dawley大鼠（275-350g）。在每日训练期之后，立即向每个受试者递送RGPF966（10mg / kg，s.c。）或媒介物（与药物治疗相当的体积）的训练后全身注射。

3）激酶实验
将各自的人重组HDAC酶在不存在和/或存在各种浓度的RGFP966和促荧光底物的情况下在室温下孵育60分钟。接下来，通过在所有孔中添加HDAC终止溶液（6mg / mL胰蛋白酶，0.3mM SAHA）来终止脱乙酰化反应，并将板在37℃下孵育20分钟。通过使用Synergy H1平板读数器测量λem= 460nm和λex= 390nm处的荧光来监测荧光7-氨基-4-甲基香豆素的释放。从阳性对照，空白和抑制孔的荧光中减去背景孔的荧光值。非线性回归用于使用GraphPad Prism [2]将数据拟合到log（抑制剂）与响应曲线。

今天介绍了RGFP966的作用，并且详细地说明了它的生物活性和实验方法。综上所述，RGFP966是一种选择性的 HDAC3 抑制剂，IC50 为80nM，浓度高达15μM时，对其他HDAC也没作用效果。它的靶点活性是HDAC3,80nM。

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参考文献：
[1]. Malvaez M, et al. HDAC3-selective inhibitor enhances extinction of cocaine-seeking behavior in a persistent manner. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Feb 12;110(7):2647-52.
[2]. Leus NG, et al. HDAC 3-selective inhibitor RGFP966 demonstrates anti-inflammatory properties in RAW 264.7 macrophages and mouse precision-cut lung slices by attenuating NF-κB p65 tranional activity. Biochem Pharmacol. 2016 May 15;108:58-74.
[3]. Jia H, et al. The Effects of Pharmacological Inhibition of Histone Deacetylase 3 (HDAC3) in Huntington's Disease Mice. PLoS One. 2016 Mar 31;11(3):e0152498.
[4]. Bieszczad KM, et al. Histone Deacetylase Inhibition via RGFP966 Releases the Brakes on Sensory Cortical Plasticity and the Specificity of Memory Formation. J Neurosci. 2015 Sep 23;35(38):13124-32.