托法替尼的生物活性

托法替尼可阻断体内某些影响免疫系统功能的酶的活性。托法替尼用于治疗成人中度至重度类风湿性关节炎或活动性银屑病关节炎，这些患者在没有成功治疗症状的情况下尝试过甲氨蝶呤等药物治疗。 托法替尼有时与甲氨蝶呤或其他关节炎药物联合使用。托法替尼还用于治疗患有中度至重度溃疡性结肠炎的成人。

一、托法替尼的生物活性详解：
1）体外活性：
托法替尼（CP-690550）柠檬酸盐可能在JAK3和JAK2处结合为2.2nM和5nM（Kd）。 该报告包括在Camk1（Kd为5,000 nM），DCamkL3（Kd为4.5 nM），Mst2（Kd为4,300 nM），Pkn1（Kd为200 nM），Rps6ka2（Kin.Dom.2-C-）的托法替尼的额外结合。 末端）（Kd为1,400 nM），Rps6ka6（Kin.Dom.2-C-末端）（Kd为1,200 nM），Snark（Kd为420 nM），Tnk1（Kd为640 nM）和Tyk2（Kd为620 nM））[1]。

2）体内活性：
与PEG处理的对照小鼠相比，用托法替尼处理的动物显示出显着更低的抗药物抗体（ADA）产生（初次免疫后5周，p <0.01，n = 8）。 此外，ADA在第28天最早可检测到。与第21天至第35天相比，SS1P的滴度相差1000至200倍。 与SS1P相比，注射了匙孔血蓝蛋白（KLH）的小鼠产生更快的抗体反应。 然而，与对照相比，托法替尼的施用降低了抗KLH滴度（第21天p <0.05，第28天p <0.01，n = 5）。 从第21天到第28天，滴度的降低分别为5000到250倍[2]。 基于之前的剂量反应研究，选择每日剂量为6.2 mg / kg的托法替尼，以提供80％的后爪体积抑制和能够抑制JAK1和JAK3信号通路> 4小时的血浆暴露[3]。

二、生物活性实验方法
1）激酶实验
JAK3激酶测定：通过PCR从全长cDNA扩增编码人JAK3（785aa至1125aa，JH1催化结构域）的催化结构域的片段，并克隆到杆状病毒转移载体pVL1393的EcoRI位点。用重组杆状病毒感染Sf9（Spodoptera frugipedra）细胞，在谷胱甘肽琼脂糖凝胶上分离重组GSTJAK3融合蛋白。用还原型谷胱甘肽洗脱融合蛋白，并储存在含有50mM Tris，pH 7.5,10mM DTT和10％甘油的缓冲液中。如下通过ELISA测量JAK3激酶活性：用随机L-谷氨酸和酪氨酸共聚物（4：1）（100μg/ mL）将板包被过夜。洗涤平板，将含有或不含抑制剂的重组JAK3 JH1：GST（100ng /孔）在室温下孵育30分钟，然后加入HRP-缀合的PY20抗磷酸酪氨酸抗体（ICN）并由TMB开发（3） ，3' ，5,5'-四甲基联）。其他激酶在大肠杆菌或昆虫细胞中产生，这取决于发现对给定激酶最佳的激酶。使用后面提到的ELISA可以简化酪氨酸激酶的催化活性，而使用放射性酶测定法测定丝氨酸/苏氨酸激酶。

2）细胞实验
为了测量IL-2依赖性增殖，将分离的淋巴细胞重悬浮至完全RPMI培养基（含有10％（w / v）胎牛血清（FCS），1％的RPMI 1640）中1-2×106 / mL的细胞密度（ w / v）青霉素和链霉素）。加入血凝素（PHA）至终浓度为10mg / mL，培养物在37℃，湿润的5％（v / v）CO2培养箱中培养3天，以上调IL -2R和JAK3表达。然后加入含有或不含有CP-690,550的IL-2（200U / mL），将细胞在37℃下在潮湿的5％（v / v）CO 2培养箱中培养72小时，之后50mL 3H-加入胸苷（5mCi / mL）。将板再孵育18小时，用96孔收获器收获，并在闪烁计数器上计数。将HUO3细胞维持在具有粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子的培养物中，并将人包皮成纤维细胞维持在含有10％胎牛血清的培养物中。将CP-690550加入到新铺板的细胞中并培养4天。在培养期的最后18小时内加入3H-胸苷。

3）动物实验
小鼠-使用雌性BALB / c小鼠（6-8周龄）。小鼠通过渗透泵输注（Alzet Model2004,0.25μL/小时，28天）在PEG300（100mg / mL）或单独的载体（PEG300）中接受托法替尼。免疫前4天，将小鼠麻醉并剃除其背部表面。在背部做一厘米的切口以形成皮下袋并插入泵。切口部位用伤口夹闭合。从第0天开始每周（i.p.）注射SS1P重组免疫毒素（RIT;5μg/小鼠）;对照小鼠仅接受盐水注射。在SS1P或载体免疫前每周，抽取50μL血液以获得血清样品。将血清储存在-80℃直至分析。
大鼠-在雌性Lewis大鼠中诱导佐剂诱导的关节炎（AIA）。根据后爪体积随机分配大鼠并将其分配给托法替尼或载体治疗方案。每个治疗组7-8只大鼠组和正常幼稚大鼠（每组n = 4）在开始治疗后4小时，4天或7天安乐死（分别在免疫后第16,20和23天） 。将托法替尼悬浮于0.5％甲基纤维素/0.025%吐温20中用于体内研究。在免疫接种后第16天开始每日口服给予载体或托法替尼（6.2mg / kg）并持续至第23天。在治疗开始后4天和7天（分别在免疫后第20天和第23天）重新评估爪体积。 ）。对于微型计算机断层扫描（micro-CT）成像，以及爪组织中的抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色，在单独的Lewis大鼠队列中诱导AIA。

综上所述，托法替尼是一种有效的 JAK3 抑制剂，IC50 值为 1 nM；同时能够抑制 JAK2，JAK1，Rock-II 和 Lck 的活性，IC50 分别为 20，112，3400 和 3870 nM。

参考文献：
[1]. Jiang JK, et al. Examining the chirality, conformation and selective kinase inhibition of 3-((3R,4R)-4-methyl-3-(methyl(7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl)amino)piperidin-1-yl)-3-oxopropanenitrile (CP-690,550). J Med Chem. 2008 Dec 25;51(24):8012-8.
[2]. Onda M, et al. Tofacitinib suppresses antibody responses to protein therapeutics in murine hosts. J Immunol. 2014 Jul 1;193(1):48-55.
[3]. LaBranche TP, et al. JAK inhibition with tofacitinib suppresses arthritic joint structural damage through decreased RANKL production. Arthritis Rheum. 2012 Nov;64(11):3531-42.
[4]. Calama E, et al. Tofacitinib ameliorates inflammation in a rat model of airway neutrophilia induced by inhaled LPS. Pulm Pharmacol Ther. 2017 Apr;43:60-67.