尼拉帕尼-作用-生物活性-尼拉帕尼靶点活性

尼拉帕尼，英文名Niraparib，别名MK-4827。它是PARP1 / PARP2的选择性抑制剂，IC50为3.8 nM / 2.1 nM; 在具有突变体BRCA-1和BRCA-2的癌细胞中具有很大活性; > PARP3，V-PARP和Tank1的选择性> 330倍。那么它的生物活性是什么？如何做实验呢？下面让小编给您详细说明。

首先我们介绍尼拉帕尼的生物活性：

1）体外活性
在全细胞测定中，MK-4827抑制PARP活性，EC50 = 4nM，并且抑制具有突变体BRCA-1和BRCA-2的癌细胞的增殖，其中CC50在10-100nM范围内。它被证明是一种有效的选择性PARP-1和PARP-2抑制剂，IC50分别为3.8和2.1 nM。此外，它显示出比PARP-3，V-PARP和端锚聚合酶-1至少100倍的选择性，IC50分别为1300,330和570nM。

由于通过RNA干扰沉默而抑制缺乏BRCA-1的HeLa细胞的生长，MK-4827能够抑制携带天然BRCA-1或BRCA-2突变的癌细胞系的增殖。在携带BRCA-1突变的MDA-MB-436人乳腺腺癌细胞中，MK-4827显示CC50 = 18 nM，而在CAPAN-1人胰腺癌细胞中，其为BRCA-2突变体，MK-4827显示CC50 = 90纳摩。相反，正常人前列腺和乳腺上皮细胞对MK-4827具有抗性，在微摩尔范围内显示出抗增殖作用，从而证明与周围组织相比，这些PARP抑制剂在BRCA-1和-2突变癌细胞中具有非常高的选择性细胞毒性。[2]。

2）体内活性
MK-4827具有良好的耐受性，并且在BRCA-1缺陷型癌症的异种移植模型中显示出作为单一药剂的功效。MK-4827在体内具有良好的耐受性，并且在BRCA-1缺陷型癌症的异种移植模型中显示出作为单一药剂的功效。MK-4827的特点是大鼠的药代动力学可接受，血浆清除率为28（mL / min）/ kg，分布容积非常高（Vdss = 6.9 L / kg），终末半衰期长（t1 / 2 = 3.4 h） 和优异的生物利用度，F = 65％[1]。在两种情况下，MK-4827均可增强p53突变体Calu-6肿瘤的放射反应，每天两次给予单剂量50 mg / kg比25 mg / kg更有效[3]。

我们已经了解了尼拉帕尼的生物活性，接下来如何做活性实验呢？一般来说，有如下的三种方法：

1）动物实验
小鼠[3]-当肿瘤生长至直径6.0mm时，将雌性裸鼠（Ncr Nu / Nu）随机分配到由5至8只小鼠组成的治疗组，此时开始用MK-4827治疗。MK-4827以25mg / kg的剂量每日两次或50mg / kg每天一次给药21天或在肿瘤直径达到8mm的第9天停药。当肿瘤直径达到8.0mm（7.7-8.2mm）时，给予分次局部肿瘤照射（XRT）。

使用由两个平行相对的137Cs源组成的小动物辐照器，每天一次连续14天或每天两次将辐射（每个部分2Gy）递送至小鼠的荷瘤腿，连续14天或连续7天，剂量率为5戈瑞/分钟。在照射期间，将未麻醉的小鼠机械固定在夹具中，使得肿瘤在3.0cm直径的辐射场内居中，并且动物的身体避免辐射暴露。在给予MK-4827和放射的那天，在当天的第一次辐射剂量之前1小时施用药物。

2）激酶实验
在含有25mM Tris，pH 8.0,1mM DTT，1mM精胺，50mM KCl，0.01％Nonidet P-40和1mM MgCl 2的缓冲液中进行酶测定。PARP反应含有0.1μCi[3H] NAD +（200000 DPM），1.5μMNAD+，150nM生物素化NAD +，1μg/ mL活化小牛胸腺和1-5nM PARP-1。利用基于SPA珠的检测的自身反应在白色96孔板中以50μL体积进行。化合物（例如，MK-4827）在96孔板中以11点连续稀释制备，5μL/孔，在5％DMSO / H 2 O（10x浓缩）中。

通过在缓冲液中加入第一个35μL的PARP-1酶并在室温下孵育5分钟然后在10μL的NAD +和DNA底物混合物中开始反应。在室温下3小时后，通过加入50μL链霉抗生物素蛋白-SPA珠（2.5mg / mL，在200mM EDTA，pH8中）终止这些反应。5分钟后，使用TopCount微孔板闪烁计数器对它们进行计数。IC50数据由各种底物浓度下的抑制曲线确定[1]。

3）细胞实验
使用HT Universal Chemiluminescent PARP Assay Kit在A549和H1299细胞中分析PARP的抑制。简言之，将细胞用DMSO或1μM镍吡啶处理15,30,60或120分钟，胰蛋白酶化，并转移至预冷管中。用冰冷的PBS洗涤细胞两次，并重悬于冷的PARP提取缓冲液中。将细胞悬浮液在冰上孵育30分钟，周期性涡旋以破坏细胞膜。将悬浮液离心，并将上清液转移到冰上预冷的管中。

将96孔板的组蛋白包被孔用1X PARP缓冲液再水化，并在室温下温育30分钟。除去PARP缓冲液，并将通过Bio-Rad蛋白质测定法测定的20μg蛋白质加入每个孔中，然后加入稀释的PARP-HSA酶和1X PARP缓冲液。然后将条带孔在室温下孵育60分钟，用含有0.1％Triton X-100的PBS洗涤两次，然后用PBS洗涤。将稀释的Strep-HRP加入到条带孔中并在室温下孵育60分钟。如前所述再次洗涤孔。将等体积的PeroxyGlow A和B组合并添加到孔中，并使用读板器立即获得化学发光读数[2]。

今天介绍了尼拉帕尼的作用，并且详细地说明了它的生物活性和实验方法。综上所述，尼拉帕尼Niraparib是高效的 PARP1 和 PARP2 抑制剂，IC50 分别为 3.8 nM 和 2.1 nM。它的靶点活性是PARP1,3.8nM；PARP2,2.1nM；PARP3,1.3μM；TANK-1,570nM；V-PARP,330nM。

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参考文献：
[1]. Jones P, et al. Discovery of 2-{4-[(3S)-piperidin-3-yl]phenyl}-2H-indazole-7-carboxamide (MK-4827): a novel oral poly(ADP-ribose)polymerase (PARP) inhibitor efficacious in BRCA-1 and -2 mutant tumors. J Med Chem. 2009 Nov 26;52(22):7170-85.
[2]. Bridges KA, et al. Niraparib (MK-4827), a novel poly(ADP-Ribose) polymerase inhibitor, radiosensitizes human lung and breast cancer cells. Oncotarget. 2014 Jul 15;5(13):5076-86.
[3]. Wang L, et al. MK-4827, a PARP-1/-2 inhibitor, strongly enhances response of human lung and breast cancer xenografts to radiation. Invest New Drugs. 2012 Dec;30(6):2113-20.