木利替尼的生物活性

木利替尼(TAK-165) 是有效，选择性的 EGFR2/HER2 抑制剂，IC50 值为6 nM。它的靶点活性为EGFR,>25μM；FGFR,>25μM；HER2/ErbB2,6.0nM；JAK1,>25μM；PDGFR,>25μM。

一、木利替尼的生物活性详解：
1）体外活性
木利替尼比其他酪氨酸激酶显示出> 4000倍的选择性，例如EGFR，FGFR，PDGFR，Jak1，Src和Blk。 即使在0.1μM的低浓度下，木利替尼显着阻断HER2磷酸化，导致具有高水平HER2的细胞系BT474中PI3K-Akt和MAPK途径的下调。 木利替尼不仅在ErbB2过度表达的癌细胞系BT474中表现出高效的抗增殖作用，IC50为5 nM，而且在HER2表达较弱的细胞系中表现出显着的抗增殖作用，LNCaP的IC50为53 nM，90 nM和91 nM， LN-REC4和T24分别为。 木利替尼对PC-3细胞没有抑制活性，HER2表达非常微弱，IC50为4.62μM，以及EGFR过表达HT1376和ACHN细胞系，IC50>25μM。

木利替尼特异性抑制HER2酪氨酸激酶，IC50为6 nM，不会抑制其他类型的酪氨酸激酶，最高可达25 000 nM。 TAK-165在HER2强表达细胞（BT474乳腺癌细胞系）中抑制HER2磷酸化及其下游Akt和MAPK。 木利替尼的灵敏度取决于每种细胞系的HER2水平。 特别是，过表达HER2的BT474细胞高度敏感（IC50 =0.005μM），表达HER2的PC-3细胞非常弱（IC50 =4.62μM）。 但是，过表达EGFR的HT1376和ACHN细胞显示出高IC50（IC50>25μM）。

2）体内活性
木利替尼显着抑制LN-REC4异种移植物，治疗/对照肿瘤体积比为26.5％。 尽管体外抑制UMUC-3和ACHN细胞的生长无效（IC50分别为1.812和>25μM），但口服莫布立尼（10或20mg / kg /天）显着抑制UMUC-3的生长和 与赫赛汀（20mg / kg）相比，ACHN异种移植物的治疗/对照肿瘤体积比分别为22.9％和26％，其对UMUC-3肿瘤生长无效。在异种移植模型中，用TAK-165处理显着抑制UMUC-3，ACHN和LN-REC4的生长。 治疗14天后的抗肿瘤效果分别为UMUC3，ACHN和LN-REC4的22.9％，26.0％和26.5％。

二、木利替尼的生物活性实验方法：
1）细胞实验
将细胞接种到6孔板中并培养过夜。 然后以各种浓度加入木利替尼，并将细胞连续处理72小时。 孵育期后，计数细胞以测量抗增殖活性。

2）动物实验
小鼠：UMUC-3和LN-REC4细胞植入50％Matrigel溶液。 在LN-REC4和UMUC-3细胞中肿瘤体积达到200-300mm3并且在ACHN中达到100-200mm3后，用载体（对照）或10或20mg / kg每天口服处理小鼠两次，持续14天。 TAK-165的一天。 在针对UMUC-3的赫赛汀研究中，治疗包括每周两次腹膜内注射PBS中20mg / kg赫赛汀2周。 通过电子卡尺测量肿瘤直径在二维中评估肿瘤生长，并计算肿瘤体积。

3）激酶实验
HER2 / erbB2酪氨酸激酶活性的抑制：将BT-474细胞接种在24孔板上并培养过夜。然后以各种浓度加入木利替尼。温育2小时后，将细胞直接收获到十二烷基硫酸钠（SDS） - 样品缓冲液（200μL）中。含有等量总细胞提取物的等分试样在7.5％至15％梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上进行。电泳后，将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，使用相关的一抗进行蛋白质印迹分析。通过增强的化学发光（ECL）检测方法完成蛋白质的检测。通过LAS-1000加lumino图像分析仪测量HER2 / erbB2的酪氨酸磷酸化程度。通过使用SAS软件的响应的最小二乘线性回归产生的剂量 - 反应曲线计算抑制HER2 / erbB2磷酸化50％的木利替尼浓度（IC50）。