巴瑞克替尼磷酸盐的生物活性和实验方法

巴瑞克替尼磷酸盐是一种选择性的，可口服的 JAK1/JAK2 抑制剂，IC50 值分别为 5.9 nM 和 5.7 nM。

一、巴瑞克替尼磷酸盐的生物活性：
1）体外活性
在基于细胞的测定中，巴瑞克替尼（INCB028050）被证明是JAK信号传导和功能的有效抑制剂。 在PBMC中，巴瑞克替尼抑制IL-6刺激的经典底物STAT3（pSTAT3）的磷酸化和随后的趋化因子MCP-1的产生，IC50值分别为44nM和40nM。 在分离的幼稚T细胞中，INCB028050还抑制IL-23刺激的pSTAT3（IC50 = 20nM）。 重要的是，这种抑制作用阻止了Th17细胞产生的两种致病细胞因子（IL-17和IL-22） - 一种具有明显炎症和致病特性的辅助性T细胞亚型 - IC50值为50nM。 与之形成鲜明对比的是，结构相似但无效的JAK1 / 2抑制剂INCB027753和INCB029843在浓度高达10μM的情况下测试时，在任何这些检测系统中均无显着影响[1]。

2）体内活性
与载体相比，巴瑞克替尼（INCB028050）治疗在2周治疗期间以1mg / kg的剂量抑制50％的后爪体积增加，并且在3或10mg / kg的剂量下抑制> 95％。 因为基线爪体积测量是在具有显着疾病迹象的动物的治疗第0天进行的，所以在肿胀中可以有> 100％的抑制作用，显示肿胀明显改善[1]。 当与载体对照处理的小鼠相比时，通过H＆E染色评估的巴瑞克替尼（0.7mg /天）处理的小鼠表现出显着减少的炎症，降低的CD8浸润和降低的MHC I类和II类表达。 与载体对照处理的小鼠相比，巴瑞克替尼处理的小鼠中CD8 + NKG2D +细胞是鼠和人秃头症（AA）中疾病的关键效应物，其大大减少[2]。

二、巴瑞克替尼磷酸盐的生物活性实验方法：
1）细胞实验
通过白细胞分离术分离人PBMC，然后进行Ficoll-Hypaque离心。 为了测定IL-6诱导的MCP-1产生，在存在或不存在各种浓度的INCB028050（1 nM，10 nM，100 nM）的情况下，将PBMC以每孔3.3×10 5个细胞接种于RPMI 1640 + 10％FCS中。 ，1μM和10μM）。 在室温下与化合物预孵育10分钟后，通过向每个孔中加入10ng / mL人重组IL-6来刺激细胞。 将细胞在37℃，5％CO 2下孵育48小时。 收获上清液并通过ELISA分析人MCP-1的水平。 INCB028050抑制IL-6诱导的MCP-1分泌的能力被报道为50％抑制所需的浓度（IC50）。 使用Cell-Titer Glo [1]在3天内进行Ba / F3-TEL-JAK3细胞的增殖。

2）动物实验
大鼠[1]
雌性大鼠（每组性别n = 6）给予10mg / kg 巴瑞克替尼剂量，并以10mL / kg口服强饲法给予。前3只大鼠在0（给药前），2小时，8小时和24小时放血，并且在给药后1,4和12小时对第二只三只大鼠放血。 EDTA用作抗凝血剂，并将样品离心以获得血浆。已经开发了用于定量INCB028050的分析方法并用于分析来自毒理学研究的样品。该方法将蛋白质沉淀萃取与10％甲醇在乙腈中进行结合并进行LC / MS / MS分析。该方法使用0.1mL研究样品证明线性测定范围为1-5000nM。使用Analyst 1.3.1处理数据。使用加权线性回归（1 / x2）从峰面积比对浓度确定标准曲线。
小鼠[2]
AA的C3H / HeJ移植受体小鼠模型用于这些实验。简言之，将来自自发性脱发的C3H / HeJ小鼠的脱发性皮肤移植到没有疾病的8-10周龄C3H / HeJ小鼠上。在移植时，植入施用约0.7mg /天的巴瑞克替尼或安慰剂的渗透泵。渗透泵每月更换一次。进行间隔删失数据的时间 - 事件生存分析。 R中的生存和间隔包用于执行对数秩检验。在（n = 10）巴瑞克替尼治疗的小鼠和（n = 10）安慰剂治疗的小鼠中，存活分布相等的假设在5％的水平被拒绝，使用Sun的评分进行精确的对数秩双样本检验p值为0.0035。

3）激酶实验
使用具有重组表位标记的激酶结构域的均相时间分辨荧光测定法（JAK1,837-1142; JAK2,828-1132; JAK3,718-1124; Tyk2,873-1187）或全长酶（cMET）进行酶测定。 和Chk2）和肽底物。 每种酶反应在有或没有测试化合物（11点稀释），JAK，cMET或Chk2酶，500nM（Chk2为100nM）肽，ATP（对每种激酶特异性的Km或1mM）下进行，和 在测定缓冲液中加入2.0％DMSO。 计算的IC 50值是抑制50％荧光信号所需的化合物浓度。 使用200nM的标准条件在Cerep进行另外的激酶测定。 测试的酶包括：Abl，Akt1，AurA，AurB，CDC2，CDK2，CDK4，CHK2，c-kit，EGFR，EphB4，ERK1，ERK2，FLT-1，HER2，IGF1R，IKKα，IKKβ，JNK1，Lck，MEK1， p38α，p70S6K，PKA，PKCα，Src和ZAP70 [1]。

综上所述：巴瑞克替尼磷酸盐是一种选择性的，可口服的 JAK1/JAK2 抑制剂。它的靶点活性为JAK1,5.9nM；JAK2,5.7nM；JAK3,>400nM；Tyk2,53nM。

参考文献：
[1]. Fridman JS, et al. Selective inhibition of JAK1 and JAK2 is efficacious in rodent models of arthritis: preclinical characterization of INCB028050. J Immunol. 2010 May 1;184(9):5298-307.
[2]. Jabbari A, et al. Reversal of Alopecia Areata Following Treatment With the JAK1/2 Inhibitor Baricitinib. EBioMedicine. 2015 Feb 26;2(4):351-5.