巴瑞克替尼的生物活性和实验方法

巴瑞克替尼是Janus激酶1和2（JAK1 / 2）的口服生物可利用抑制剂，具有潜在的抗炎，免疫调节和抗肿瘤活性。

一、巴瑞克替尼的生物活性：
1）体外活性
在分离的未成熟型T 细胞中（IC50=20 nM），巴瑞克替尼抑制IL-23刺激的STAT3的磷酸化。在外周血单核细胞中，巴瑞克替尼抑制IL-6刺激底物STAT3的磷酸化（IC50=44 nM）以及随后趋化因子MCP-1（IC50=40 nM）的产生。

2）体内活性
在佐剂性关节炎大鼠模型中巴瑞克替尼（10mg / kg口服）可抑制JAK1 / 2信号传导，同时抑制免疫浸润。在CIA和CAIA模型中，巴瑞克替尼（10 mg / kg）改善软骨损伤和炎症，抑制迟发型超敏反应。

二、巴瑞克替尼的实验方法：
1）细胞实验
将巴瑞克替尼（INCB 028050）溶解于储备溶液中，然后在使用前用适当的培养基稀释[1]。 通过白细胞分离术分离人PBMC，然后进行Ficoll-Hypaque离心。 为了测定IL-6诱导的MCP-1产生，在存在或不存在各种浓度的INCB028050（1 nM，10 nM，100 nM）的情况下，将PBMC以每孔3.3×10 5个细胞接种于RPMI 1640 + 10％FCS中。 ，1μM和10μM）。 在室温下与化合物预孵育10分钟后，通过向每个孔中加入10ng / mL人重组IL-6来刺激细胞。 将细胞在37℃，5％CO 2下孵育48小时。 收获上清液并通过ELISA分析人MCP-1的水平。 INCB028050抑制IL-6诱导的MCP-1分泌的能力被报道为50％抑制所需的浓度（IC50）。 使用Cell-Titer Glo [1]在3天内进行Ba / F3-TEL-JAK3细胞的增殖。

2）动物实验
大鼠[1]
雌性大鼠（每组性别n = 6）给予10mg / kg 巴瑞克替尼剂量，并以10mL / kg口服强饲法给予。前3只大鼠在0（给药前），2小时，8小时和24小时放血，并且在给药后1,4和12小时对第二只三只大鼠放血。 EDTA用作抗凝血剂，并将样品离心以获得血浆。已经开发了用于定量INCB028050的分析方法并用于分析来自毒理学研究的样品。该方法将蛋白质沉淀萃取与10％甲醇在乙腈中进行结合并进行LC / MS / MS分析。该方法使用0.1mL研究样品证明线性测定范围为1-5000nM。使用Analyst 1.3.1处理数据。使用加权线性回归（1 / x2）从峰面积比对浓度确定标准曲线。
小鼠[2]
AA的C3H / HeJ移植受体小鼠模型用于这些实验。简言之，将来自自发性脱发的C3H / HeJ小鼠的脱发性皮肤移植到没有疾病的8-10周龄C3H / HeJ小鼠上。在移植时，植入施用约0.7mg /天的巴瑞克替尼或安慰剂的渗透泵。渗透泵每月更换一次。进行间隔删失数据的时间 - 事件生存分析。 R中的生存和间隔包用于执行对数秩检验。在（n = 10）巴瑞克替尼治疗的小鼠和（n = 10）安慰剂治疗的小鼠中，存活分布相等的假设在5％的水平被拒绝，使用Sun的评分进行精确的对数秩双样本检验p值为0.0035。

3）激酶实验
使用具有重组表位标记的激酶结构域的均相时间分辨荧光测定法（JAK1,837-1142; JAK2,828-1132; JAK3,718-1124; Tyk2,873-1187）或全长酶（cMET）进行酶测定。 和Chk2）和肽底物。 每种酶反应在有或没有测试化合物（11点稀释），JAK，cMET或Chk2酶，500nM（Chk2为100nM）肽，ATP（对每种激酶特异性的Km或1mM）下进行，和 在测定缓冲液中加入2.0％DMSO。 计算的IC 50值是抑制50％荧光信号所需的化合物浓度。 使用200nM的标准条件在Cerep进行另外的激酶测定。 测试的酶包括：Abl，Akt1，AurA，AurB，CDC2，CDK2，CDK4，CHK2，c-kit，EGFR，EphB4，ERK1，ERK2，FLT-1，HER2，IGF1R，IKKα，IKKβ，JNK1，Lck，MEK1， p38α，p70S6K，PKA，PKCα，Src和ZAP70 [1]。

综上所述：巴瑞克替尼是Janus激酶1和2（JAK1 / 2）的口服生物可利用抑制剂，具有潜在的抗炎，免疫调节和抗肿瘤活性。它的靶点活性为JAK1,5.9nM；JAK2,5.7nM；JAK3,>400nM；Tyk2,53nM；Chk2,>1μM。

参考文献：
[1]. Fridman JS, et al. Selective inhibition of JAK1 and JAK2 is efficacious in rodent models of arthritis: preclinical characterization of INCB028050. J Immunol. 2010 May 1;184(9):5298-307.
[2]. Jabbari A, et al. Reversal of Alopecia Areata Following Treatment With the JAK1/2 Inhibitor Baricitinib. EBioMedicine. 2015 Feb 26;2(4):351-5.
[3]. Khan IM, et al. Intermuscular and perimuscular fat expansion in obesity correlates with skeletal muscle T cell and macrophage infiltration and insulin resistance. Int J Obes (Lond). 2015 Nov;39(11):1607-18.