培利替尼的生物活性_培利替尼的实验方法

培利替尼 (EKB-569;WAY-EKB 569) 是可逆的 EGFR 抑制剂，IC50 值为38.5 nM。也可轻微抑制Src，MEK/ERK 和 ErbB2，IC50 值分别为282，800，和1255 nM。

一、培利替尼的生物活性详解：
1）体外活性
培利替尼对EGFR激酶的抑制活性大于对Src，MEK / ERK，Cdk4，c-Met，Raf和ErbB2的抑制活性，例如，EGFR的IC50比密切相关的ErbB2的IC50低32倍。 培利替尼导致EGFR磷酸化显着降低，但EGFR蛋白总量没有变化。 在相似的测定中，它需要至少10倍的药物来等效地抑制ErbB2磷酸化，并且EKB-569不会阻止以相同方式评估的另一种受体酪氨酸激酶（c-Met）的磷酸化[1]。 EKB-569是NHEK，A431和MDA-468细胞中增殖的有效抑制剂（分别为IC50 = 61,125和260nM），但不是MCF-7细胞（IC50 = 3600nM）。 EKB-569也是A431和NHEK细胞中EGF诱导的磷酸化EGF-R（pEGF-R）的有效抑制剂（IC50 = 20-80 nM）[1]。培利替尼（75-500 nM）可特异性抑制AKT和ERK1/2的活化，而对NF-κB通路无影响。在正常人角质细胞中，培利替尼也可有效抑制TGF-α介导的EGFR活化（IC50：56 nM），抑制STAT3和ERK1/2的活化（IC50：60 nM和62 nM）。在A431和正常人角质细胞中，培利替尼对EGF诱导的EGFR磷酸化有抑制作用（IC50：20-80 nM），还抑制STAT3的磷酸化（IC50：30-70 nM）。 培利替尼对正常人角质细胞（IC50：61 nM），以及A431（IC50：125 nM）和MDA-468（IC50：260 nM）肿瘤细胞的增殖有明显抑制作用，但对MCF-7细胞活性较低（IC50：3.6 μM）。

2）体内活性
单次口服10mg / kg EKB-569在60分钟内抑制A431异种移植物中的EGFR磷酸化。 二十四小时后，通过该单次口服剂量，EGFR活性仍被抑制超过50％。 EKB-569在小鼠血浆中的半衰期约为2小时[1]。在达EGFR的A431异种移植模型中，培利替尼（10 mg/kg，p.o.）可有效抑制EGFR磷酸化，1 h内抑制90%，24 h后抑制率>50%。小鼠气道上皮细胞重构模型，可被病毒感染诱导，具有延迟但永久性转变为杯状细胞化生的特点，培利替尼（20 mg/kg/day）可完全阻断纤毛细胞的增加和Clara细胞的减少，从而从3个方面校正上皮细胞重构，并明显抑制杯状细胞的发生。培利替尼（20 mg/kg/day）抑制APCMin/+小鼠体内87%的肿瘤发生，与2倍剂量EKI-785（40 mg/kg/day）的作用接近，与体内活性较高一致。 培利替尼对体内气道上皮细胞中EGFR信号有选择性抑制效果。

二、培利替尼的实验方法：
1）细胞实验
将1×104个NSCLC细胞转移到96孔板的每个孔中，并在无血清培养基中培养过夜，用于EGFR磷酸化测定。 在第二天加入BIBW2992后，将板在37℃温育1小时。 在室温下使用100ng / mL进行EGF刺激10分钟。 用冰冷的PBS洗涤细胞，每孔用120μLHEPEX缓冲液提取并在室温下振荡1小时。 在所有2×104个细胞中，每孔用于HER2磷酸化测定。 链霉抗生物素蛋白预涂板用在封闭缓冲液和c-erb2 / HER2癌蛋白Ab-5（克隆N24） - 生物素中以1：100稀释的抗EGFR-生物素包被。 然后将细胞提取物转移到涂有抗体的孔中，并在室温下温育1小时。 消光在450nm处测量。

2）动物实验
小鼠：对于体内实验，将无胸腺nu / nu雌性小鼠皮下植入5×106个A431肿瘤细胞。 当肿瘤达到200-300mg的质量时，每次灌胃用pH 2.0的水中的单剂量10mg / kg EKB-569处理动物。 切除来自对照和药物处理的动物的肿瘤并切碎成1mm的片用于分析[1]。

3）激酶实验
细胞中EGFR的自磷酸化：对于使用培养细胞的实验，用不同浓度的培利替尼处理A431细胞2.75小时，然后与100ng / mL EGF共孵育0.25小时。用冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞两次，然后加入裂解缓冲液（10mM Tris，pH 7.5,5mM乙二胺四乙酸（EDTA），150mM NaCl，1％Triton X-100,1％）在免疫沉淀和免疫沉淀之前，在冰上将脱氧胆酸钠，0.1％SDS，1mM PMSF，10mg / mL胃蛋白酶抑制剂A，10mg / mL亮抑酶肽，20KIU / mL抑肽酶，2mM原钒酸钠和100mM氟化钠在冰上保持20分钟。 SDS-PAGE印迹。对于免疫沉淀，将培养的细胞置于冷的裂解缓冲液中并立即在冰上用具有几个脉冲的polytron匀浆。首先将匀浆物以2500rpm（20分钟，4℃）离心，然后在微量离心机中以14,000rpm再次离心（10分钟，4℃）。将上清液（1000μg蛋白质）在4℃下与15mL EGFR多克隆抗体一起温育2小时。 2小时后，加入50μL蛋白G + /蛋白A琼脂糖珠，并在4℃下恒定旋转孵育2小时。用裂解缓冲液洗涤后，将珠子在Laemmli样品缓冲液中煮沸2分钟。然后通过SDS-PAGE分离蛋白质，转移至固定膜并用与辣根过氧化物酶（HRP）缀合的抗磷酸酪氨酸抗体探测过夜。使用ECL试剂开发膜。通过剥离膜和用受体特异性抗体重新探测来确定总EGFR蛋白。使用具有Molecular Dynamics激光透射扫描仪的ImageQuant软件，通过光密度测定法进行条带的定量。

综上所述：培利替尼（EKB-569）是一种有效的不可逆EGFR抑制剂（IC50：38.5 nM）。它的靶点活性为EGFR,38.5nM；HER2/ErbB2,1.255μM；MEK,800nM；Raf,3.353μM；Src,282nM。

参考文献：
[1]. Torrance CJ, et al. Combinatorial chemoprevention of intestinal neoplasia. Nat Med. 2000 Sep;6(9):1024-8.
[2]. Nunes M, et al. Phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase 1 and 2, protein kinase B, and signal transducer and activator of tranion 3 are differently inhibited by an epidermal growth factor receptor inhibitor, EKB-569, in tumor cells and normal human keratinocytes. Mol Cancer Ther. 2004 Jan;3(1):21-7.