达克替尼的生物活性_达克替尼的实验方法

达克替尼是一种特异性的不可逆抑制剂 ERBB 家族抑制剂，作用于 EGFR，ERBB2 和 ERBB4，IC50 分别为 6 nM，45.7 nM 和 73.7 nM。

一、达克替尼的生物活性详解：
1）体外活性
达克替尼（PF00299804）有效抑制野生型EGFR的体外激酶活性（IC50 = 6 nM），具有相似的功效。 达克替尼还有效抑制野生型ERBB2，IC50为45.7 nM。在H441中，使用达克替尼达到IC50，但仅在非常高的浓度（4μM）下达到并且可能反映了脱靶效应。在EGFR和K-ras（H322，H1819和Calu-3）的野生型细胞系中，吉非替尼和达克替尼均有效抑制H1819和Calu-3细胞的生长，但不抑制H322细胞的生长。 达克替尼是泛ERBB抑制剂，大多数EGFR突变细胞系表达多个ERBB家族成员，对EGFR磷酸化的影响可能是间接的。 达克替尼抑制所有不同EGFR T790M蛋白的EGFR磷酸化，而吉非替尼即使在10μM时也无效。在NIH3T3细胞中，EGFR L858R / T790M的磷酸化被1nM 达克替尼完全抑制，而抑制EGFR WT / T790M或Del / T790M需要100nM或更高[1]。 HER2扩增的细胞系对达克替尼的生长抑制最敏感（16个细胞系中14个IC50 <1μM; 87.5％），而HER2非扩增细胞系（不包括永生化细胞系）的28个细胞中有5个（17.9％）[2] 。

达克替尼对EGFR信号传导有抑制作用，并可促使含EGFR T790M的H3255 GR细胞系凋亡。达克替尼对表达T790M 突变体的H3255和 HCC827细胞的生长具有抑制作用。在HER2-扩增的胃癌细胞中，达克替尼诱导细胞凋亡和G1期阻滞，并抑制HER家族及其下游信号通路，包括STAT3，AKT和细胞外信号调节激酶(ERK)中受体的磷酸化。达克替尼还可阻断SNU216细胞中EGFR/HER2，HER2/HER3和HER3/HER4异质二聚体形成，以及HER3与p85α的结合。在大多数敏感细胞系中，达克替尼对HER2，EGFR，HER4，AKT和ERK的磷酸化水平具有降低作用。达克替尼通过G0/G1期阻滞和对细胞凋亡的诱导发挥其抗增殖作用。在47种人乳腺癌和永生的乳腺上皮细胞系中，相对于非扩增细胞系(RR = 3.39, p < 0.0001)，达克替尼优先抑制HER-2-扩增的乳腺癌细胞系的生长。

2）体内活性
达克替尼（15mg/kg，p.o.）具有较强的抗肿瘤活性。其可引起各种人肿瘤异种移植模型中明显的肿瘤退化，如表达和/或过表达ERBB家族成员，或与耐埃罗替尼和吉非替尼相关的含有双重突变(L858R/T790M)的ERBB1 (EGFR)异种移植模型。为了评估达克替尼的功效，使用HCC827 GFP和HCC827Del / T790M细胞产生nu / nu小鼠中的异种移植物，并用达克替尼处理小鼠。 达克替尼（每日口服强饲10mg / kg / d）有效抑制HCC827 GFP异种移植物的生长。 相比之下，HCC827 Del / T790M异种移植物对吉非替尼具有抗性，而达克替尼治疗在抑制该异种移植模型的生长方面显着更有效[1]。

二、达克替尼的实验方法：
1）动物实验
小鼠[1]-裸鼠（nu / nu; 6-8周龄）用于体内研究。 使用2％异氟烷（Baxter）吸入氧气混合物麻醉小鼠。 将5×106 HCC827-GFP或HCC827-Del / T790M肺癌细胞（在0.2mL PBS中）的悬浮液皮下接种。 进入每只小鼠侧翼的右下象限。 在吉非替尼治疗组中用HCC827-GFP或HCC827-Del / T790M细胞接种5只小鼠。 使用卡尺每周测量肿瘤两次，并使用以下公式计算体积：长度×宽度2×0.52。 每天监测小鼠的体重和一般状况。 当平均肿瘤体积为400至500mm 3时，将小鼠随机分配至治疗。 通过每日口服强饲法给予吉非替尼150mg / kg / d。 通过每日口服强饲法以10mg / kg / d施用达克替尼。 当对照肿瘤的平均大小达到2000mm 3时终止实验。

2）细胞实验
在24孔板中以5×103至5×10 4个细胞/孔接种细胞，并计算生长抑制数据。 简而言之，接种后第二天，以10μM加入达克替尼，并进行12倍浓度的2倍稀释以产生剂量 - 反应曲线。 还接种没有药物的对照孔。 在添加药物的第1天以及实验结束后6天后计数细胞。 胰蛋白酶消化后，将细胞置于Isotone溶液中，并立即使用Coulter Z1颗粒计数器计数。 使用Coulter Vi-Cell计数器计数悬浮培养物[2]。

3）激酶实验
基于ELISA的ERBB激酶测定：ERBB1，ERBB 2和ERBB4细胞质融合蛋白通过克隆ERBB1序列（Met-668至Ala-1211），ERBB2（Ile-675至Val-1256）和ERBB4序列（使用PCR将Gly-259至Gly-690）转化为杆状病毒载体pFastBac。蛋白质在杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞中表达为GST融合蛋白。使用谷胱甘肽琼脂糖珠通过亲和层析纯化蛋白质。使用基于ELISA的受体酪氨酸激酶测定评估ERBB酪氨酸激酶活性的抑制。激酶反应（50 mM HEPES，pH 7.4,125 mM NaCl，10 mM MgCl2,100μM原钒酸钠，2 mM二硫苏糖醇，20μMATP，PF299804或载体对照，每50μL反应混合物含1-5 nM GST-erbB） ）在涂有0.25mg / mL聚-Glu-Tyr的96孔板中运行。将反应物在室温下温育6分钟，同时摇动。通过除去反应混合物终止激酶反应，然后用洗涤缓冲液（0.1％吐温20的PBS溶液）洗涤孔。通过添加0.2μg/ mL抗磷酸酪氨酸抗体（致癌基因Ab-4;50μL/孔）来检测磷酸化酪氨酸残基，所述抗体与在含有3％BSA和0.05％吐温20的PBS中稀释的辣根过氧化物酶（HRP）偶联25分钟，同时在37℃下摇动室内温度。除去抗体，并将板在洗涤缓冲液中洗涤。加入HRP底物（SureBlue3,3 +，5,5'-四甲基联苯胺或TMB）（每孔50μL）并孵育10-20分钟，同时在室温下摇动。加入50μL终止溶液（0.09N H 2 SO 4）终止TMB反应。通过测量450nm处的吸光度来量化信号。使用中值效应方法测定PF299804的IC 50值。

综上所述：达克替尼（PF299804; PF-00299804）是酪氨酸激酶HER家族的高选择性，口服生物可利用的小分子抑制剂，EGFR，ERBB2和ERBB4的IC50分别为6,45.7和73.7 nM。它的靶点活性为EGFR,6.0nM；HER2/ErbB2,73.7nM。

参考文献：
[1]. Engelman JA, et al. PF00299804, an irreversible pan-ERBB inhibitor, is effective in lung cancer models with EGFR and ERBB2 mutations that are resistant to gefitinib. Cancer Res. 2007 Dec 15;67(24):11924-32.
[2]. Kalous O, et al. Dacomitinib (PF-00299804), an irreversible Pan-HER inhibitor, inhibits proliferation of HER2-amplified breast cancer cell lines resistant to trastuzumab and lapatinib. Mol Cancer Ther. 2012 Sep;11(9):1978-87.