塞卡替尼的生物活性_塞卡替尼的实验方法

塞卡替尼（AZD0530）是一种有效的Src抑制剂（IC50：2.7 nM），对c-Yes，Lyn，Fyn，Fgr，Blk和Lck有效; 对Abl和EGFR（L858R和L861Q）的活性较低。

一、塞卡替尼的生物活性详解：
1）体外活性
塞卡替尼（AZD0530）是一种可口服的Src抑制剂，在体外表现出有效的抗迁移和抗侵袭作用，并抑制膀胱癌小鼠模型的转移。 塞卡替尼的抗增殖活性在细胞系之间变化（IC500.2-10μM）。 塞卡替尼有效抑制Src3T3小鼠成纤维细胞的增殖，并在含有内源性Src的一系列人癌细胞系中表现出可变的抗增殖活性。 观察到用塞卡替尼（肿瘤类型：结肠，前列腺，肺和白血病）测试的五种人癌细胞系的亚微摩尔生长抑制，IC 50值为0.2-0.7μM。 在3天MTS细胞增殖测定中，塞卡替尼抑制Bcr-Abl驱动的人白血病细胞系K562的增殖，IC50为0.22μM。 在微滴迁移试验中，塞卡替尼以浓度依赖性方式减少人肺癌A549细胞的迁移（IC500.14μM）[1]。

塞卡替尼在NBT-II膀胱癌细胞中，明显阻断HT1080细胞通过立体骨胶原基质的入侵，且完全抑制EGF诱导的细胞分散。塞卡替尼在活性，再吸收，及组成上抑制蚀骨细胞。塞卡替尼也可逆阻断蚀骨细胞前体的移动。塞卡替尼作用于DU145和PC3细胞，通过抑制Y419磷酸化而有效抑制Src激活。塞卡替尼抑制前列腺癌包括PC3, DU145, CWR22Rv1和LNCaP的生长，而塞卡替尼作用于 LAPC-4, PZ-HPV7和RWPE-1细胞时却显示低活性。塞卡替尼使细胞周期停止在G1/S期，但是不使caspase 3断裂。塞卡替尼也有效抑制其他Src酪氨酸激酶家族成员，包括 Fyn，c-Yes，Blk，Lyn，Fgr和Lck（IC50：4-10 nM）。塞卡替尼有效抑制SrcY530F突变的NIH 3T3细胞（IC50：80 nM）。塞卡替尼还对Boyden小室的DU145和PC3 移动有明显抑制作用。塞卡替尼有效且持久抑制Akt，且增强A549和Calu-6细胞对放射处理的敏感性。

2）体内活性
塞卡替尼（25mg/kg，p.o.）在常位DU145鼠具有强的抗癌活性。塞卡替尼可有效抑制Src3T3异体移植物的肿瘤生长，其还使Calu-6, MDA-MB-231, AsPc-1和BT474C移植瘤生长适当延迟。塞卡替尼（AZD0530）处理以剂量依赖性方式有效抑制皮下移植的Src3T3成纤维细胞在小鼠和大鼠中的增殖。 在两种模型中，在≥6mg/ kg /天的剂量下观察到肿瘤生长的显着抑制（在小鼠中抑制60％，在用载体处理的动物中抑制98％），并且在所研究的最大剂量下，完全抑制肿瘤生长。 观察到（小鼠25mg / kg /天100％抑制，大鼠10mg / kg /天）[1]。

二、塞卡替尼的实验方法：
1）动物实验
小鼠和大鼠[1]-使用雌性无胸腺小鼠（nu / nu）和大鼠（RH-rnu / rnu）。 通过口服管饲法每天一次处理动物，使用单独的载体或萨拉替尼6.25-50mg / kg，持续10-91天。 计算肿瘤生长抑制。 对于药代动力学和药效学分析，人道地处死动物并收集样品（血浆和肿瘤）。 将肿瘤样品用5倍体积的水匀浆并用氯仿萃取。 分析血浆和肿瘤样品的塞卡替尼浓度，使用高效液相色谱，固相萃取后进行串联质谱检测。

2）细胞实验
使用比色5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）细胞增殖ELISA试剂盒评估细胞增殖。 简而言之，将细胞接种到96孔板（1.5×10 4细胞/孔）上，第二天加入0.039-20μM沙拉替尼的DMSO溶液（终浓度为0.5％），将细胞培养24小时。 用BrdU脉冲标记细胞2小时并固定。 然后用提供的溶液使细胞DNA变性，并与抗BrdU过氧化物酶一起温育90分钟。 用磷酸盐缓冲盐水洗涤三次后，加入四甲基联苯胺底物溶液，将平板在平板振荡器上培养10-30分钟，直至690nm处的阳性对照吸光度为约1.5吸光度单位[1]。

3）激酶实验
使用全长活化的人Src在连续的偶联测定中进行塞卡替尼抑制的可逆性和机制的研究。 ATP和肽底物（Src II肽）浓度依次变化（ATP40-1280μM; Src II肽100-800μM），与塞卡替尼（0-30 nM）一起，在不变基质的饱和浓度下 （ATP 1.6mM; Src II肽1.0mM）。 使用BIAcore抑制 - 溶液测定法测量塞卡替尼对失活的Src（在酪氨酸527处磷酸化，而不是酪氨酸416）的结合亲和力。 该测定遵循塞卡替尼和固定的脲基喹唑啉之间的竞争结合以结合Src。 使用GraFit，版本5通过未加权非线性回归进行数据分析，并使用F检验来确定最合适的方程[1]。

酪氨酸激酶活性的IC 50通过酶联免疫吸附测定（ELISA）测量，其中一组受体和非受体酪氨酸激酶的重组催化结构域（在一些情况下仅使用部分催化结构域）。 塞卡替尼剂量范围为0.001-10mM。针对一组丝氨酸/苏氨酸激酶的特异性试验使用32P的过滤捕获试验进行。 简单来说，含有0.5μL塞卡替尼或对照（DMSO）单独或pH 3.0缓冲液对照的多点384平板与15μL酶加肽/蛋白质底物孵育5分钟，然后通过加入10μL20mM开始反应MG-ATP。对于所有酶，最终浓度近似为米氏常数（Km）。在室温下进行测定30分钟，然后加入5μL正磷酸终止。混合后，将孔内容物收集到P81 Uni滤板上，使用正磷酸作为洗涤缓冲液。然后计算IC50。

综上所述：塞卡替尼是一种有效的 Src 抑制剂，IC50 为 2.7 nM，也抑制 EGFRL861Q (IC50=4 nM)，EGFRL858R (IC50=5 nM) 和 v-Abl (IC50=30 nM)。它的靶点活性为BLK,11nM；c-Kit,200nM；c-Src,2.7nM；c-Yes,4nM；EGFR,66nM；EGFR (L858R),5nM；EGFR (L861Q),4nM；EphA2,236nM；FGR,10nM；Fyn,10nM；Lck,<4nM；Lyn,5nM；v-Abl,30nM。

参考文献：
[1]. Green TP, et al. Preclinical anticancer activity of the potent, oral Src inhibitor AZD0530. Mol Oncol, 2009, 3(3), 248-261.
[2]. Fuse MA, et al. Combination Therapy With c-Met and Src Inhibitors Induces Caspase-Dependent Apoptosis of Merlin-Deficient Schwann Cells and Suppresses Growth of Schwannoma Cells. Mol Cancer Ther. Mol Cancer Ther. 2017 Nov;16(11):2387-2398.