卡奈替尼的生物活性_卡奈替尼的实验方法

卡奈替尼是一种pan-erbB酪氨酸激酶抑制剂，可在体外和体内对食管鳞状细胞癌起作用。 通过PET测定，卡奈替尼治疗显着影响肿瘤代谢，增殖和缺氧。

一、卡奈替尼的生物活性详解：
1）体外活性
卡奈替尼以剂量依赖性方式显着抑制培养的黑素瘤细胞RaH3和RaH5的生长。 IC50约为0.8μM，并且在5μM内，两种细胞系在治疗72小时内完全生长停滞。 用1μM卡奈替尼孵育指数生长的RaH3和RaH5，在处理24小时内将细胞积聚在细胞周期的G1期，而不诱导细胞凋亡。 1μM卡奈替尼抑制ErbB1-3受体磷酸化，伴随着两种细胞系中Akt-，Erk1 / 2-和Stat3活性的降低[2]。卡奈替尼显示出对MDA-MB 453细胞中erbB2自磷酸化的不可逆抑制的优异效力。 卡奈替尼还显示Caco-2细胞的高渗透性并抑制长春碱的分泌转运，这表明卡奈替尼可能是P-gp的抑制剂。 [1]仅卡奈替尼，显着抑制组成型活化的Akt和MAP激酶。与吉西他滨组合，卡奈替尼抑制Akt并防止MAPK磷酸化水平增加。 卡奈替尼刺激MDA-MB-453细胞中的p27表达和p38磷酸化。 [2] 卡奈替尼对erbB受体家族具有高度特异性，即使在50μM时对PGFR，FGFR或IR也不敏感。 卡奈替尼在表达EGFR的A431细胞中显示出高水平的抑制，IC50为7.4nM。 卡奈替尼抑制metgulin刺激的erbB2，erbB3和erbB4的酪氨酸磷酸化，IC5​​0分别为5,14和10nM。 卡奈替尼还响应于调蛋白抑制pp62c-fos的表达。 [3]预计卡奈替尼在HER2激酶的ATP结合位点内共价修饰Cys773，并增强成熟和未成熟ErbB-2分子的破坏。 [4] 卡奈替尼诱导EGFR的酪氨酸残基845和1068的可测量的磷酸化显着降低，其分别负责Src和Ras / MAPK信号传导。 Her-2，酪氨酸残基877和1248的相应残基被卡奈替尼在3μM或更高的浓度下显着去磷酸化。 CI可以以可滴定的方式阻断EGFR内化并增加原发性骨肉瘤细胞的凋亡率。 [5]此外，卡奈替尼在0.1nM时显着抑制TT，TE2，TE6和TE10细胞的增殖。 [6]

2）体内活性
卡奈替尼显示出优异的体内抗肿瘤活性，使口服给药后A431异种移植物的生长延迟超过50天[1]。 通过腹膜内注射显着抑制人恶性黑色素瘤异种移植物RaH3和RaH5在裸鼠中的生长。 注射40mg / kg /天的卡奈替尼（图4）。 对黑素瘤异种移植物的抗增殖作用在治疗后4天内已经可见，并且在整个治疗期间进一步增加，如通过肿瘤体积的差异所观察到的，在治疗的18天内达到统计学显着性[2]。卡奈替尼显示在5mg / kg体重的裸鼠中针对A431异种移植物的令人印象深刻的活性。 [1] 卡奈替尼（20至80 mg / kg / d）在H125异种移植模型中实现高度的肿瘤消退。 [3]口服卡奈替尼引起裸鼠TT，TE6和TE10异种移植物生长的显着抑制，没有动物死亡和<10％体重减轻。[6]

二、卡奈替尼的实验方法：
1）动物实验
小鼠：当肿瘤显示可靠的生长时，卡奈替尼治疗开始。 将小鼠随机分为对照组和治疗组。 在卡奈替尼处理的RaH3组（n = 4）和RaH5组（n = 7）中，每只小鼠接受i.p. 每周5天，在0.1ml 0.15M NaCl中注射1.2mg卡培替尼（40mg / kg /天）。 对照RaH3（n = 3）和RaH5（n = 7）小鼠接受腹膜内注射。 仅根据相同的方案注射载体。 在治疗期结束时，通过颈椎脱位处死小鼠，然后取出肿瘤并称重[2]。

2）细胞实验
将细胞（1×104）接种在24孔塑料培养板的每个孔中，并在补充有10％FBS的DMEM或RPMI-1640中放置过夜。 第二天早晨，用指定浓度的卡奈替尼（0.1-5.0nM）处理细胞不同时期（1,3,5和7天）。 处理后，使用Coulter计数器计数细胞。 通过该公式计算细胞增殖百分比：每个时间段的处理细胞数/对照细胞数×100（仅供参考）。

3）激酶实验
酪氨酸激酶测定：用于测定IC50的酶测定在96孔滤板中进行，总体积为0.1mL，含有20mM Hepes，pH 7.4,50mM钒酸钠，40mM氯化镁，10μM三磷酸腺苷（ATP） ）含有0.5mCi的[32P] ATP，20mg的聚谷氨酸/酪氨酸，10ng的EGFR酪氨酸激酶和适当稀释的卡奈替尼。 将除ATP外的所有组分加入孔中，并将板在25℃下振荡孵育10分钟。 通过加入[32P] ATP开始反应，并将板在25℃下再温育10分钟。 加入0.1mL 20％三氯乙酸（TCA）终止反应。 将板在4℃下保持至少15分钟以使底物沉淀。 然后用0.2mL 10％TCA洗涤孔5次，用Wallacβ平板计数器测定32P掺入。

综上所述：卡奈替尼 (PD-183805) 是有效地，不可逆的 EGFR 抑制剂；抑制细胞 EGFR 和 ErbB2 自身磷酸化的 IC50 值分别为7.4和9 nM。它的靶点活性为EGFR,1.5nM；HER2/ErbB2,9.0nM。

参考文献：
1. Smaill JB et al. J Med Chem. 2000; 43(7): 1380-1397.
2. Nelson JM et al. J Biol Chem. 2001; 276(18): 14842-14827.
3. Slichenmyer WJ et al. Semin Oncol. 2001; 28(5 Suppl 16): 80-85.
4. Citri A et al. EMBO J. 2002; 21(10): 2407-2417.
5. Hughes DP et al. Pediatr Blood Cancer. 2006; 46(5): 614-623.
6. Ako E et al. Oncol Rep. 2007; 17(4): 887-893.
7. Erlichman C, et al. Cancer Res, 2001, 61(2), 739-748.