2-甲氧基雌二醇的生物活性和实验方法

2-甲氧基雌二醇是具有潜在抗肿瘤活性的口服生物可利用的雌二醇代谢物。 2-甲氧基雌二醇通过减少内皮细胞增殖和诱导内皮细胞凋亡来抑制血管生成。 该试剂还通过与微管蛋白结合抑制肿瘤细胞生长，导致抗有丝分裂活性，并通过诱导胱天蛋白酶活化，导致G2期细胞周期停滞，DNA片段化和细胞凋亡。

一、2-甲氧基雌二醇的生物活性详解：
1）体外活性
2-甲氧基雌二醇（5-100μM）以浓度依赖性方式抑制纯化的微管蛋白的装配，在200μM2-甲氧基雌二醇（2ME2）下具有最大抑制（60％）。然而，对于含有微管相关蛋白的微管，解聚微管需要显着更高的2-甲氧基雌二醇浓度，并且在500μM2-甲氧基雌二醇时聚合物质量仅减少13％。 4μM2-甲氧基雌二醇使平均生长速率降低17％，动态性降低27％。对于有丝分裂停滞的IC50的活间期MCF7细胞（1.2μM），2-甲氧基雌二醇显​​着抑制平均微管生长速率，持续时间和长度，以及整体动态性，与其体外作用一致，并且没有任何可观察到的微管解聚。 2-甲氧基雌二醇在许多活跃分裂的细胞类型中诱导G2-M阻滞和凋亡，同时保留静止细胞。 2-甲氧基雌二醇在秋水仙碱位点或附近与微管蛋白结合，抑制微管组装，并且已显示高浓度解聚细胞中的微管。 2-甲氧基雌二醇诱导G2-M阻滞和细胞凋亡，许多活跃分裂也阻断有丝分裂并抑制内皮细胞迁移[1]。 2-甲氧基雌二醇（2-ME）在缺氧条件下培养的细胞中降低HIF-1α和HIF-2α核染色。当细胞在常氧和缺氧条件下暴露于2-甲氧基雌二醇时，HIF-1α和HIF-2αmRNA水平显着降低。 2-甲氧基雌二醇是一种抗血管生成，抗增殖和促凋亡剂，可抑制HIF-1α蛋白水平及其转录活性。在96小时时，与DMSO处理的细胞（分别为66.2±7.2和101.2±2.3％; p = 0.04）相比，在10μM2-甲氧基雌二醇处理的A549细胞中发现生长速率的显着降低。浓度为10μM的2-甲氧基雌二醇用于凋亡和HIF-1α和HIF-2α表达测定，这是由于当细胞在常氧条件下在72小时温育时发现该浓度的重要性。与含氧量较低的细胞（5.8±0.2％; p = 0.003）相比，在常氧条件下用10μM2-甲氧基雌二醇处理的细胞中观察到细胞凋亡显着增加[2]。

2）体内活性
为了研究2ME2对葡萄膜炎发展的影响，将C57BL / 6小鼠随机分成两组并用IRBP肽免疫。 2ME2组从第0天至第13天腹膜内开始2-甲氧基雌二醇（15mg / kg），而对照组给予载体。 2-甲氧基雌二醇（2ME2）组的病变评分为0.30±0.30，显着低于对照组2.09±0.28（p <0.05），每组含5只小鼠[3]。 用2-甲氧基雌二醇（60-600mg / kg / d）治疗导致肿瘤生长的剂量依赖性抑制。 在2-甲氧基雌二醇处理组中，具有强烈的哌莫胺阳性染色（+++）的细胞百分比显着降低（60mg / kg / d为36.0％，200和600mg / kg / d为0％） 与媒介物治疗组（86.5％）。 这可能是由于2-甲氧基雌二醇治疗后剂量依赖性地显着抑制肿瘤生长[4]。

二、2-甲氧基雌二醇的实验方法：
1）动物实验
小鼠[3]-使用6~8周龄的C57BL / 6小鼠。 C57BL / 6小鼠在尾部皮下免疫0.1mL，在大腿部位用IRBP抗原复合物皮下免疫0.05mL。 同时注射500ng百日咳毒素。 这一天定为第0天。然后将小鼠分成4组，每组包含5只小鼠。 在0-13天，0-6天和7-13天腹腔注射15mg / kg 2-甲氧基雌二醇或载体。 在第14天，在安乐死后收集眼睛或淋巴结。
大鼠[4]-用i.p.处理Fischer 344大鼠（平均体重= 150g，每组n = 6）。 在初始肿瘤细胞注射后第8天开始注射载体（60,200或600mg / kg /天的2-甲氧基雌二醇/ Panzem）连续9天。 每组使用三只大鼠第二次重复实验。

2）细胞实验
用绿色荧光蛋白（GFP）-α-微管蛋白稳定转染的MCF7乳腺癌细胞在补充有非必需氨基酸，0.1％青霉素/链霉素，10％胎牛血清和0.4mg / mL G418的DMEM中于37℃培养。 5％的二氧化碳。用GFP-α-微管蛋白进行MCF7细胞的转染。为了评估有丝分裂指数，将细胞以6×104 / 2mL的浓度接种到六孔板中。 48小时后，将细胞在不存在或存在2-甲氧基雌二醇的情况下以100nM至30μM的浓度温育20小时。为了收集漂浮和附着的细胞，收集培养基;用Versene（137mM NaCl，2.7mM KCl，1.5mM KH 2 PO 4,8.1mM Na 2 HPO 4和0.5mM EDTA）冲洗附着的细胞，通过胰蛋白酶消化分离，并加回到培养基中。通过离心收集细胞并用10％福尔马林固定30分钟，在冰冷的甲醇中透化10分钟，并用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚染色以显现细胞核。结果是7个实验的平均值和SE，每个实验对每个浓度计数500个细胞。有丝分裂IC50是诱导最大有丝分裂积累一半的药物浓度[1]。

3）激酶实验
将微管蛋白（2.75 mg / mL）装配成稳态[在100 mM PIPES中含有1 mM EGTA和1 mM MgSO4（PEM100）和1 mM GTP，35°C 45分钟]，含有2-甲氧基雌二醇（最终药物浓度） 1-500μM）。 最终的DMSO和乙醇浓度分别调节至1％和5％。 2-甲氧基雌二醇≤5μM的浓度对微管聚合物质量没有影响，因此大多数实验使用20-500μM的2-甲氧基雌二醇。 用2-甲氧基雌二醇孵育30分钟，此时微管解聚最大，将微管在35℃离心30分钟，从沉淀中除去上清液。 将微管颗粒在0.2M NaOH中溶解过夜，测定上清液和沉淀的蛋白质浓度[1]。

综上所述：2-甲氧基雌二醇是一种 microtubule 和 HIF-1 抑制剂，在秋水仙碱位点或附近结合到 tubulin，且抑制微管聚合，通过干扰正常微管功能而发挥作用。它的靶点活性为HIF-1α,HIF-2α,Microtubule depolymerization。

参考文献：
[1]. Kamath K, et al. 2-Methoxyestradiol suppresses microtubule dynamics and arrests mitosis without depolymerizing microtubules. Mol Cancer Ther. 2006 Sep;5(9):2225-33.
[2]. Aquino-Gálvez A, et al. Effects of 2-methoxyestradiol on apoptosis and HIF-1α and HIF-2α expression in lung cancer cells under normoxia and hypoxia. Oncol Rep. 2016 Jan;35(1):577-83.
[3]. Xu L, et al. 2-Methoxyestradiol Alleviates Experimental Autoimmune Uveitis by Inhibiting Lymphocytes Proliferation and T Cell Differentiation. Biomed Res Int. 2016;2016:7948345.
[4]. Kang SH, et al. Antitumor effect of 2-methoxyestradiol in a rat orthotopic brain tumor model. Cancer Res. 2006, 66(24),11991-11997.