生根粉263的生物活性和实验方法

生根粉263是一种口服活性的合成小分子，是具有潜在抗肿瘤活性的B细胞白血病2（Bcl-2）蛋白家族子集的拮抗剂。

一、生根粉263的生物活性详解：
1）体外活性
生根粉263（ABT-263）对PPTP体外组中大约一半的细胞系具有活性。 面板中所有线的中位IC50为1.91μM[1]。 生根粉263与化疗药物联合使大多数卵巢癌细胞系具有协同反应，并且在SK-OV-3和IGROV-1细胞系中测试的所有紫杉醇剂量下都能增强caspase活化[2]。ABT-263对过量表达的Bcl-2和Bcl-XL显示出保护作用，EC50分别为60和20 nM。EC50值<400 nM的所有四种细胞系（H146，H889，H1963和H1417）对ABT-737高度敏感，并且两种最具抗性的细胞系（H1048和H82）对ABT-263具有相似的抗性。ABT-263有效抑制Bcl-2蛋白家族，用荧光偏振分析法测试ABT-263作用于Bcl-xL，Bcl-2和Bcl-w时，Ki分别为0.5，1和1 nM。

2）体内活性
生根粉263（100 mg / kg / day，p.o。）也可改善小鼠异种移植物肿瘤亚组中苯达莫司汀 - 利妥昔单抗（BR）的反应[3]。单独口服ABT-263会导致小细胞肺癌和急性淋巴细胞白血病的异种移植模型中的肿瘤完全消退。当在H345异种移植模型中以100 mg/kg/天给予ABT-263时，结果肿瘤生长抑制率达80%，肿瘤体积减小了50%以上，显示出ABT-263极强的抗癌效果。在侵袭性B细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤的异种移植模型中，ABT-263单独作用效果不明显，其显著增强其他相关用药的药性。

二、生根粉263的实验方法：
1）动物实验
对于系统性Granta 519肿瘤模型，在第0天通过尾静脉在0.1mL体积的细胞培养基中注射2×10 6个细胞，并在第14天开始治疗。在整个实验过程中对所有动物进行耳标记和单独监测。 生根粉263通过口服管饲法每天一次在Phosal 50PG：PEG400：乙醇的混合物中施用。 苯达莫司汀和利妥昔单抗静脉给药。 在第1天分别为25和10mg / kg。在苯达莫司汀和利妥昔单抗之前约2小时施用生根粉263。 所有试验均由每组10只小鼠组成。 当肿瘤达到> 2000mm3的大小或监测到任何窘迫迹象时，小鼠被人道地杀死。 窘迫的迹象包括失去行走，呼吸困难或体重减轻>每笼平均体重20％。

2）细胞实验
将细胞以每孔3,000个细胞接种于384孔板中。 24小时后，用9×7矩阵的生根粉263（剂量范围14nM-3.3μM）和紫杉醇（剂量范围15pM-100nM）或吉西他滨（剂量范围0.5nM-3.3μM）处理细胞。 每个处理一式四份进行。 将细胞处理72小时，并使用CellTiter-Glo测定法测定细胞活力。 将每种处理的细胞活力相对于DMSO对照组标准化。

将人肿瘤细胞系SCLC细胞系维持在37℃，含有5％CO 2。 SCLC细胞系在含有10％胎牛血清（FBS），1％丙酮酸钠，25mM HEPES，4.5g / L葡萄糖和1％青霉素/链霉素的RPMI 1640中培养。 白血病和淋巴瘤细胞系在补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI 1640中培养。 将细胞（1-5×10 4）通过ABT-263在96孔培养板中处理48小时，最终体积为100μL，并用CellTiter Glo测定法评估细胞毒性。 测定ABT-263的体外细胞毒性。

3）激酶实验
为了测量胱天蛋白酶-3/7活化，将IGROV-1和SKOV3细胞以每孔5,000个细胞接种在96孔板中。 24小时后，使用相同的剂量浓度，用生根粉263（1μM），紫杉醇（剂量范围= 1-100nM）或与生根粉263和紫杉醇组合处理细胞。 每个处理在一式两份孔中进行。 使用Caspase-Glo 3/7测定法测定在0,4,24和48小时处理后诱导细胞凋亡。 所有研究都包括DMSO对照。 实验进行两次，数据以两次运行的平均值表示。

用竞争性荧光偏振测定法测定ABT-263与Bcl-2家族的不同同种型的结合亲和力（Ki或IC50）。 使用以下肽探针/蛋白质对：f-bad（1nM）和Bcl-xL（6nM），f-Bax（1nM）和Bcl-2（10nM），f-Bax（1nM）和 Bcl-w（40nM），f-Noxa（2nM）和Mcl-1（40nM），和f-Bax（1nM）和Bcl-2-A1（15nM）。 还使用时间分辨荧光共振能量转移测定法测定Bcl-xL的结合亲和力。 将Bcl-xL（1nM，His标记的）与200nM f-Bak，1nM Tb标记的抗His抗体和ABT-263在室温下混合30分钟。 使用340 / 35nm激发滤光片和520/525（f-Bak）和495 / 510nm（Tb标记的抗-His抗体）发射滤光片在Envision读板仪上测量荧光。

综上所述：生根粉263 是一种有效的，可口服的 Bcl-2 抑制剂，对抗凋亡 Bcl-2 蛋白家族 (包括Bcl-xL，Bcl-2 和 Bcl-w) 具有高亲和力，Ki 值小于 1 nM。它的靶点活性为Bcl-2,<=1nM(Ki)；Bcl-w,<=1nM(Ki)；Bcl-xL,<=0.5nM(Ki)。

参考文献：
[1]. Lock R1, et al. Initial testing (stage 1) of the BH3 mimetic ABT-263 by the pediatric preclinical testing program. Pediatr Blood Cancer. 2008 Jun;50(6):1181-1189.
[2]. Wong M, et al. Navitoclax (ABT-263) reduces Bcl-x(L)-mediated chemoresistance in ovarian cancer models.Mol Cancer Ther. 2012 Apr;11(4):1026-1035.
[3]. Ackler S, et al. Navitoclax (ABT 263) and Bendamustine±Rituximab Induce Enhanced Killing of Non-Hodgkin's Lymphoma Tumors in Vivo. Br J Pharmacol. 2012 Oct;167(4):881-891.