帕纳替尼_作用_生物活性_实验方法

帕纳替尼是一种酪氨酸激酶受体抑制剂，用于治疗费城染色体阳性的难治性慢性粒细胞白血病（CML）。

一、帕纳替尼的生物活性详解：
1）体外活性
帕纳替尼（AP24534）有效抑制天然ABL（IC50：0.37nM），ABLT315I（IC50：2.0nM）和其他临床上重要的ABL激酶结构域突变体（IC50：0.30-0.44nM）。 帕纳替尼还抑制SRC（IC50：5.4nM）和受体酪氨酸激酶的VEGFR，FGFR和PDGFR家族成员。 帕纳替尼有效抑制表达天然BCR-ABL的Ba / F3细胞的增殖（IC50：0.5nM）。所有测试的BCR-ABL突变体对帕纳替尼（IC50：0.5-36 nM）仍然敏感，包括BCR-ABLT315I（IC50：11 nM）[1]。 帕纳替尼（AP24534）抑制FLT3，KIT，FGFR1和PDGFRα的体外激酶活性，IC50值分别为13,13,2和1nM。 帕纳替尼以剂量依赖性方式抑制所有4种RTK的磷酸化，IC5​​0值在0.3至20nM之间。与这些激活的受体一致，在驱动白血病发生中，帕纳替尼也有效地抑制所有4种细胞系的生存力，IC50值为0.5至17nM。相反，抑制RS4的IC50;表达天然（未突变的）FLT3的11个细胞超过100nM [2]。

2）体内活性
在其中小鼠注射Ba / F3 BCR-ABLT315I细胞的存活模型中，以高达300mg / kg的剂量施用达沙替尼对存活时间没有影响。相比之下，使用帕纳替尼（AP24534）治疗可以剂量依赖的方式延长生存期。 帕纳替尼以5,15和25mg / kg口服给药19天，将中位存活时间延长至19.5,26和30天，分别比载体处理小鼠的16天（所有三个剂量水平p <0.01）。在异种移植模型中进一步评估帕纳替尼（AP24534）的抗肿瘤活性，其中将Ba / F3 BCR-ABLT315I细胞皮下注射到小鼠中。与媒介物处理的小鼠相比，帕纳替尼以剂量依赖性方式抑制肿瘤生长，在每日口服10和30mg / kg时显着抑制肿瘤生长（％T / C = 68％和20％;两种剂量水平均p <0.01）。每日口服50mg / kg 帕纳替尼导致显着的肿瘤消退（％T / C = 0.9％，p <0.01），与治疗开始时相比，最终测量的平均肿瘤体积减少96％。在研究期间，帕纳替尼在所有有效剂量水平下都具有良好的耐受性;对于10,30和50mg / kg剂量组，体重的最大降低分别<5％，<5％和<12％，没有明显毒性的迹象[1]。将帕纳替尼（1-25mg / kg）口服给药，每天一次，持续28天，给予携带MV4-11异种移植物的小鼠。 帕纳替尼以剂量依赖性方式有效抑制肿瘤生长。施用1mg / kg（测试的最低剂量）导致肿瘤生长的显着抑制（TGI = 46％，P <0.01），并且2.5mg / kg或更大剂量导致肿瘤消退[2]。

二、帕纳替尼的实验方法：
1）动物实验
小鼠[1]-对于Ba / F3存活模型，将表达天然BCR-ABL或BCR-ABLT315I的Ba / F3细胞注射到雌性SCID小鼠的尾静脉中（100μL在无血清培养基中的1×10 7个细胞/ mL悬浮液）。开始72小时后，通过用载体（25mM柠檬酸盐缓冲液，pH 2.75），帕纳替尼或达沙替尼口服管饲法每天一次处理小鼠，连续19天。根据IACUC指南牺牲濒死动物。在尸检时，由于肿瘤细胞浸润，小鼠有明显的脾肿大。使用Kaplan-Meier方法分析存活数据，并且使用Log-rank测试评估统计显着性，比较每个治疗组与媒介物组的存活时间。对于Ba / F3肿瘤模型，将Ba / F3 BCR-ABLT315I细胞皮下植入雌性裸鼠的右胁腹（100μL在无血清培养基中的1×10 7个细胞/ mL细胞悬浮液）。当平均肿瘤体积达到约500mm 3时，将小鼠随机分配至治疗组。用载体（25mM柠檬酸盐缓冲液，pH 2.75）或帕纳替尼口服管饲法每天一次处理小鼠，连续19天。计算肿瘤体积（mm 3）。为了在治疗期结束时确定肿瘤生长抑制，在最终测量时计算治疗组的平均肿瘤体积/对照组的平均肿瘤体积（％T / C）。

2）细胞实验
将Ba / F3细胞系分布在96孔板（4×103细胞/孔）中，并与升高浓度的帕纳替尼孵育72小时。 使用的抑制剂范围是：对于表达BCR-ABL的细胞为0-625nM，对于BCR-ABL阴性细胞为0-10,000nM。 使用基于甲硫基磺酸盐（MTS）的活力测定法测量增殖。 IC50值报告为一式四份进行的三次独立实验的平均值。 对于使用CML或正常原代细胞的细胞增殖实验，将单核细胞接种于96孔板（5×104细胞/孔）中，在梯度浓度的帕纳替尼（0-1000nM）中，在补充有10％FBS，L-谷氨酰胺的RPMI中 ，青霉素/链霉素和100μMβ-巯基乙醇。 孵育72小时后，通过对细胞进行MTS测定来评估细胞活力[1]。

3）激酶实验
具有GST-Abl激酶结构域的肽底物磷酸化测定：通过使用合成肽底物（Abltide：EAIYAAPFAKKK）评估AP24534（0-320nM）对GST-Abl激酶活性的影响。在25μL反应混合物中在30℃下进行测定15分钟：8mM MOPS（pH 7），0.2mM EDTA，50μMAbltide，30mM MgCl2,10mMβ-甘油磷酸酯，1mM EGTA，0.002％ Brij-35,0.4mM DTT，0.2mg / mL BSA，0.4mM原钒酸钠，10nM WT或突变体GST-Abl激酶，和100μMATP/γ-32 [P] ATP（5000cpm / pmol）。通过将一部分反应混合物转移到p81磷酸纤维素滤膜上并浸入0.75％磷酸中终止反应。将过滤器在0.75％磷酸中洗涤3次，在丙酮中漂洗，并风干;通过闪烁计数确定磷酸盐掺入。通过从激酶反应中省略肽底物来确定所有结果的背景与滤膜的结合。在激酶测定之前建立酶活性线性范围的时程实验。

综上所述：帕纳替尼是一种口服有效的多靶点激酶抑制剂，作用于 Abl，PDGFRα，VEGFR2，FGFR1 和 Src，IC50 分别为 0.37 nM，1.1 nM，1.5 nM，2.2 nM 和 5.4 nM。它的靶点活性为Abl,0.37nM；c-Kit,12.5nM；c-Src,5.4nM；FGFR1,2.2nM；PDGFRα,1.1nM；VEGFR2,1.5nM。

参考文献：
[1]. O'Hare T, et al. AP24534, a pan-BCR-ABL inhibitor for chronic myeloid leukemia, potently inhibits the T315I mutant and overcomes mutation-based resistance. Cancer Cell, 2009, 16(5), 401-412.
[2]. Gozgit JM, et al. Potent activity of ponatinib (AP24534) in models of FLT3-driven acute myeloid leukemia and other hematologic malignancies. Mol Cancer Ther, 2011, 10(6), 1028-1035.
[3]. Uchida T, et al. Hes1 upregulation contributes to the development of FIP1L1-PDGRA-positive leukemia in blast crisis. Exp Hematol. 2014 May;42(5):369-379.e3.