马赛替尼_作用_生物活性_实验方法

马赛替尼是一种酪氨酸激酶抑制剂，用于治疗动物，特别是狗的肥大细胞肿瘤。 自2008年11月推出以来，它已经以商业名称Masivet分发。 它自2009年第二季度开始在欧洲上市。在美国，它以Kinavet的名义分发，自2011年起可供兽医使用。

一、马赛替尼的生物活性详解：
1）体外活性
马赛替尼是一种抗ATP的竞争性抑制剂，浓度≤500nM。 马赛替尼还有效抑制重组PDGFR和细胞内激酶Lyn，并在较小程度上抑制成纤维细胞生长因子受体3.相反，马赛替尼显示出对Abl和c-Fms的弱抑制。与伊马替尼相比，马赛替尼更强烈地抑制脱颗粒，细胞因子产生和骨髓肥大细胞迁移。在表达人野生型Kit的Ba / F3细胞中，masitinib抑制SCF（干细胞因子）诱导的细胞增殖，IC50为150nM，而抑制IL-3刺激的增殖的IC50约为>10μM。在表达PDGFRα的Ba / F3细胞中，masitinib抑制PDGF-BB刺激的增殖和PDGFRα酪氨酸磷酸化，IC5​​0为300nM。 马赛替尼还在肥大细胞瘤细胞系和BMMC中引起SCF刺激的人Kit的酪氨酸磷酸化的抑制。 马赛替尼抑制Kit功能获得性突变体，包括V559D突变体和Δ27小鼠突变体，在Ba / F3细胞中IC50为3和5nM。 马赛替尼抑制包括HMC-1α155和FMA3在内的肥大细胞瘤细胞的增殖，IC50分别为10和30 nM [1]。 马赛替尼在两种新的ISS细胞系中抑制细胞生长和PDGFR磷酸化，这表明马赛替尼显示出对原发性和转移性ISS细胞系的活性，并且可能有助于ISS的临床管理[2]。

2）体内活性
马赛替尼在30 mg / kg时抑制肿瘤生长并增加表达Δ27的Ba / F3肿瘤模型的中位存活时间，无心脏毒性或遗传毒性[1]。 与狗中的安慰剂相比，马赛替尼（12.5 mg / kg / d，p.o。）增加总体TTP（肿瘤扩展时间）[3]。 马赛替尼 /吉西他滨的组合在体外对吉西他滨难治性细胞系Mia Paca2和Panc1的增殖具有协同作用，并且在较小程度上对小鼠的Mia Paca-2胰腺肿瘤具有增殖作用[4]。

二、马赛替尼的实验方法：
1）动物实验
雄性Nog-SCID小鼠（7周龄）在20±1℃下在12小时光照/ 12小时黑暗循环中处于无特定病原体的条件下，随意获取食物和过滤水。如上所述培养Mia Paca-2细胞。在第0天（D0），将小鼠在200μLPBS中注射107个Mia Paca-2细胞到右侧腹中。允许肿瘤生长1.5至4周，直至达到所需的肿瘤大小（约200mm 3）。在第28天，将动物分配到四个治疗组（每组n = 7到8），确保每组的平均体重和肿瘤体积匹配良好。然后给予治疗长达4周，之后处死动物。治疗方法包括：a）对照组每日无菌水，b）每周两次腹腔注射（ip）50 mg / kg吉西他滨，c）每日灌胃100 mg / kg masitinib，或d）腹腔注射联合注射每周两次50mg / kg吉西他滨，每日灌胃100mg / kg马西替尼。用卡尺测量肿瘤大小，并使用以下公式估计肿瘤体积：体积=（长度×宽度2）/ 2。肿瘤生长抑制率计算为（100）×（治疗组的中位肿瘤体积）/（对照组的中位肿瘤体积）。

2）细胞实验
对于Ba / F3细胞增殖的测定，将微量滴定板以总共104个细胞/孔接种于100μL含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中，37℃。 这些补充或不补充来自X63-IL-3细胞的0.1％条件培养基或250ng / mL鼠SCF。 激活Kit的鼠SCF从产生SCF的CHO细胞的条件培养基中纯化。 细胞在37℃下与马赛替尼一起生长48小时，然后与10μL/孔的WST-1试剂在37℃下孵育3小时。 形成的甲dye染料的量通过使用扫描多孔分光光度计在450nm处的吸光度来量化。 没有细胞的空白孔用作分光光度计的背景对照。

3）激酶实验
用重组蛋白激酶进行体外酶联免疫测定：将96孔微量滴定板用0.25mg / ml聚（Glu，Tyr 4：1）包被过夜，用250μL洗涤缓冲液（10mM磷酸盐缓冲盐水[2次]冲洗两次[ pH7.4]和0.05％吐温20）并在室温下干燥2小时。在室温下进行测定，最终体积为50μL，在含有ATP的激酶缓冲液（10mM MgCl 2,1mM MnCl 2,1mM原钒酸钠，20mM HEPES，pH 7.8）中，每种浓度至少为Km的两倍。酶和适量的重组酶确保线性反应速率。在引入酶时开始反应，并且每5M尿素混合物加入一个反应体积（50μL）的100mM EDTA终止反应。将板洗涤三次并与1：30,000辣根过氧化物酶缀合的抗磷酸酪氨酸单克隆抗体一起温育，然后洗涤三次并与四甲基联苯胺一起温育。通过分光光度法在450nm处定量最终反应产物。

综上所述：马赛替尼是一种有效的 Kit 和 PDGFRα/β 抑制剂，IC50 值为 200 nM 和 540 nM/800 nM，对ABL 和 c-Fms也有微弱抑制作用。它的靶点活性为Abl1,1.20μM；c-Fms,1.48mM；Hck,2.0μM；Kit,200nM；Lyn B,510nM；PDGFRα,540nM；PDGFRβ,800nM；Src,1.87μM。

参考文献：
[1]. Dubreuil P, et al. Masitinib (AB1010), a Potent and Selective Tyrosine Kinase Inhibitor Targeting KIT. PLoS One, 2009, 4(9), e7258.
[2]. Lawrence J, et al. Masitinib demonstrates anti-proliferative and pro-apoptotic activity in primary and metastatic feline injection-site sarcoma cells. Vet Comp Oncol, 2011, doi: 10.1111/j.1476-5829.2011.00291.x.
[3]. Hahn KA, et al. Masitinib is safe and effective for the treatment of canine mast cell tumors. J Vet Intern Med, 2008, 22(6), 1301-1309.
[4]. Humbert M, et al. Masitinib combined with standard gemcitabine chemotherapy: in vitro and in vivo studies in human pancreatic tumour cell lines and ectopic mouse model. PLoS One. 2010 Mar 4;5(3):e9430.