诺考达唑_作用_生物活性_实验方法

诺考达唑是微管聚合的合成抑制剂，在无细胞试验中也抑制Abl（IC50：0.21μM），Abl（E255K，IC50：0.53μM）和Abl（T315I，IC50：0.64μM）。 诺考达唑与β-微管蛋白结合并破坏微管组装/拆卸动力学。

一、诺考达唑的生物活性详解：
1）体外活性
诺考达唑对c-KIT表现出良好的亲和力，在高度恶性的人癌细胞中Kd值为1.6μM。 诺考达唑对促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径的组分显示出良好的结合亲和力，例如BRAF（Kd =1.8μM），BRAF（V600E）（Kd =1.1μM），MEK1（Kd =1.7μM），和 MEK2（Kd =1.6μM）[1]。 诺考达唑对αβIV的亲和力最高，对αβIII的亲和力最低[2]。 从nocodazole阻滞释放后，有丝分裂同步的细胞对非常低浓度的紫杉醇敏感，持续<30分钟，即纺锤体形成所需的时间，但对长春碱保持敏感> 90分钟[3]。 诺考达唑（1 nM）诱导COLO 205癌细胞凋亡[4]。 诺考达唑（≥30μg/ mL）显着增加膜联蛋白-V结合细胞的百分比，而不显着改变人红细胞的平均前向散射[5]。

诺考达唑与癌症相关激酶具有较高亲和力，如磷酸化ABL（Kd：0.091 μM），c-KIT（Kd：1.6 μM），BRAF（Kd：1.8 μM）和MEK（Kd：1.6 μM）。诺考达唑对ABL(E255K)磷酸化（Kd：0.12 μM）， ABL(T315I) 磷酸化（Kd：0.17 μM），BRAF(V600E)（Kd：1.1 μM）和PI3Kγ（Kd：1.5 μM）的亲和性也很高。高浓度诺考达唑可使细胞中微管迅速解聚，而低浓度可抑制微管的动态不稳定。经诺考达唑同步化处理6 h的分裂期细胞，加入不同浓度的紫杉醇后，可使G1期阻滞（IC50：4nM）。

2）体内活性
在COLO205肿瘤移植模型中，诺考达唑与酮康唑联用对凋亡的诱导效果有加强作用，对小鼠的肿瘤体积和重量也有更强地抑制效果。

二、诺考达唑的实验方法：
1）动物实验
动物模型：具有COLO-205肿瘤异种移植物的裸鼠。

2）细胞实验
COLO 205细胞在补充有10％FCS的RPMI 1640中生长。 通过连续两次胰蛋白酶消化收获细胞，以300×g离心; 保持5分钟，洗涤两次，并重悬于无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。 将0.1mL的细胞（5×105）皮下注射到每只裸鼠的肩胛骨之间。 移植后，用卡尺测量肿瘤大小，估计肿瘤体积。 一旦肿瘤达到平均大小200 mm3，动物每周三次腹膜内注射DMSO（25μL），酮康唑（50 mg / kg），诺考达唑（5 mg / kg）或酮康唑+诺考达唑，持续6周。

综上所述：诺考达唑是一种快速可逆的 microtubule 聚合抑制剂，也能够有效抑制ABL，ABL(E255K) 和 ABL(T315I) 的活性，IC50 值分别为 0.21 μM，0.53 μM 和 0.64 μM；同时可以增强 CRISPR/Cas9 的活性。它的靶点活性为Abl,0.21μM；Abl (E255K),0.53μM；Abl (T315I),0.64μM；microtubule。

参考文献：
[1]. Park H, et al. Nocodazole is a high-affinity ligand for the cancer-related kinases ABL, c-KIT, BRAF, and MEK. ChemMedChem. 2012 Jan 2;7(1):53-6.
[2]. Keliang Xu, et al. Interaction of nocodazole with tubulin isotypes. Drug Development Research 2002
[3]. Long BH, et al. Paclitaxel inhibits progression of mitotic cells to G1 phase by interference with spindle formation without affecting other microtubule functions during anaphase and telephase. Cancer Res. 1994 Aug 15;54(16):4355-61.
[4]. Wang YJ, et al. Ketoconazole potentiates the antitumor effects of nocodazole: In vivo therapy for human tumor xenografts in nude mice. Mol Carcinog. 2002 Aug;34(4):199-210.
[5]. Signoretto E, et al. Nocodazole Induced Suicidal Death of Human Erythrocytes. Cell Physiol Biochem. 2016;38(1):379-92.
[6]. Zhang JP, et al. Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biol. 2017 Feb 20;18(1):35.