克唑替尼的作用和生物活性

克唑替尼是一种激酶抑制剂。克唑替尼的作用机制为细胞色素P4503A抑制剂和受体酪氨酸激酶抑制剂，细胞色素P4502B6抑制剂和P-糖蛋白抑制剂，以及有机阳离子转运蛋白1抑制剂和有机阳离子转运蛋白2抑制剂。

一、克唑替尼的生物活性详解：
1）体外活性
克唑替尼在mIMCD3小鼠或MDCK犬上皮细胞中显示出相似的针对c-Met磷酸化的效力，IC50分别为5nM和20nM。与NIH3T3细胞相比，克唑替尼显示出针对NIH3T3细胞的改善或相似的活性，所述NIH3T3细胞经工程改造以表达c-MetATP结合位点突变体V1092I或H1094R或P-环突变体M1250T，IC50分别为19nM，2nM和15nM。表达野生型受体，IC50为13nM。相反，与野生型受体相比，观察到针对经工程改造以表达c-Met活化环突变体Y1230C和Y1235D的细胞的克唑替尼效力的显着变化，IC5​​0分别为127nM和92nM。

克唑替尼还有效地阻止了NCI-H69和HOP92细胞中c-Met的磷酸化，IC5​​0分别为13nM和16nM，分别表达内源性c-Met变体R988C和T1010I[1]。克唑替尼还有效抑制Karpas299或SU-DHL-1ALCL细胞中的NPM-ALK磷酸化，IC5​​0为24nM。克唑替尼有效阻止细胞增殖，这与ALK阳性ALCL细胞中G（1）-S期细胞周期停滞和诱导细胞凋亡有关，IC50为30nM，而ALK阴性淋巴瘤细胞则不然[2]。此外，克唑替尼可预防与原发肿瘤生长（即增殖和存活）以及转移相关的骨肉瘤行为[3]。

2）体内活性
克唑替尼显示在50mg/kg/天和75mg/kg/天治疗队列中引起大规模肿瘤（>600mm3）明显消退的能力，平均肿瘤体积减少60％。在另一项研究中，克唑替尼显示出完全抑制GTL-16肿瘤生长>3个月的能力，12个小鼠中只有1个在50个/kg/3个月的治疗方案中显示肿瘤生长显着增加。在GTL-16肿瘤中以12.5mg/kg/天，25mg/kg/天和50mg/kg/天观察到CD31阳性内皮细胞的显着剂量依赖性减少，表明MVD的抑制显示剂量与抗肿瘤效果的相关性。

在GTL-16和U87MG模型中，克唑替尼显示出人类VEGFA和IL-8血浆水平的显着剂量依赖性降低。在p.o.后，在GTL-16肿瘤中观察到磷酸化的c-Met，Akt，Erk，PLCλ1和STAT5水平的显着抑制。施用克唑替尼[1]。克唑替尼可预防与原发性肿瘤生长和转移相关的骨肉瘤行为。在通过口服强饲法用克唑替尼处理的裸鼠中，克唑替尼预防了骨肉瘤异种移植物的生长和相关的骨溶解和皮层外骨基质的形成[3]。用50mg/kg克唑替尼处理c-MET-扩增的GTL-16异种移植物引起肿瘤消退，其与18F-FDG摄取的缓慢减少相关并且降低葡萄糖转运蛋白1，GLUT-1的表达[4]。

二、克唑替尼的生物活性实验方法：
1）动物实验
携带异种移植物（300-800mm3）的无胸腺小鼠通过口服强饲法在指定剂量水平下给予克唑替尼水溶液。在施用克唑替尼后的指定时间，对小鼠进行人道安乐死，并切除肿瘤。将肿瘤快速冷冻并使用液氮冷却的cryomortar和研杵进行粉碎，产生蛋白质裂解物，并使用BSA测定法测定蛋白质浓度。使用捕获ELISA或免疫沉淀-免疫印迹方法测定总蛋白和磷酸化蛋白的水平。

2）细胞实验
在补充有10％FBS（生长培养基）的培养基中以低密度将肿瘤细胞接种在96孔板中，24小时后转移至无血清培养基（0％FBS和0.04％BSA）。向每个孔中加入适当的对照或指定浓度的克唑替尼，并将细胞培养24至72小时。将人脐带血管内皮细胞（HUVEC）以每孔>20,000个细胞接种于EGM2培养基中的96孔板中5至6小时，并转移至无血清培养基中过夜。

第二天，向每个孔中加入适当的对照或指定浓度的克唑替尼，并在孵育1小时后，将HGF以100ng/mL加入指定的孔中。进行3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物测定以确定相对肿瘤细胞或HUVEC数。

3）激酶实验
将细胞接种于96孔板中的补充有10％胎牛血清（FBS）的培养基中，并在24小时后转移至无血清培养基[含0.04％牛血清白蛋白（BSA）]。在研究配体依赖性RTK磷酸化的实验中，添加相应的生长因子长达20分钟。在用克唑替尼孵育细胞1小时和/或适当的配体指定时间后，用补充有1mMNa3VO4的HBSS洗涤细胞一次，并从细胞产生蛋白质裂解物。

随后，通过夹心ELISA方法评估所选蛋白激酶的磷酸化，使用用于包被96孔板的特异性捕获抗体和对磷酸化酪氨酸残基特异的检测抗体。将抗体包被的平板（a）在蛋白质裂解物存在下于4℃温育过夜;（b）在PBS中的1％吐温20中洗涤7次;（c）在辣根过氧化物酶偶联的抗-总-磷酸酪氨酸（PY-20）抗体（1：500）中孵育30分钟;（d）再次洗七次;（e）在3,3'，5,5'-四甲基联苯胺过氧化物酶底物中温育以引发比色反应，通过加入0.09NH2SO4终止反应;（f）使用分光光度计测量450nm的吸光度。

综上所述：克唑替尼是有效的c-Met和ALK抑制剂，在细胞试验中的IC50值分别为11nM和24nM。它的靶点活性为ALK,24nM；c-Met,11nM。

参考文献：
[1]. Zou HY, et al. An orally available small-molecule inhibitor of c-Met, PF-2341066, exhibits cytoreductive antitumor efficacy through antiproliferative and antiangiogenic mechanisms. Cancer Res. 2007, 67(9), 4408-4417.
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[3]. Sampson ER, et al. The orally bioavailable met inhibitor PF-2341066 inhibits osteosarcoma growth and osteolysis/matrix production in a xenograft model. J Bone Miner Res. 2011, 26(6), 1283-1294.
[4]. Cullinane C, et al. Differential (18)F-FDG and 3'-deoxy-3'-(18)F-fluorothymidine PET responses to pharmacologic inhibition of the c-MET receptor in preclinical tumor models. J Nucl Med. 2011 Aug;52(8):1261-7
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