苹果酸舒尼替尼的作用和生物活性

苹果酸舒尼替尼是基于吲哚酮的酪氨酸激酶抑制剂的口服生物可利用的苹果酸盐，具有潜在的抗肿瘤活性。舒尼替尼阻断血管内皮生长因子受体2（VEGFR2），血小板衍生生长因子受体b（PDGFRb）和c-kit的酪氨酸激酶活性，从而抑制血管生成和细胞增殖。

一、苹果酸舒尼替尼的生物活性详解：
1）体外活性
苹果酸舒尼替尼也是KIT和FLT-3的良好抑制剂[1]。在生物化学测定中，舒尼替尼（SU11248）显示出针对Flk-1和PDGFRβ的竞争性抑制（关于ATP），Ki值分别为9nM和8nM。舒尼替尼也是一种竞争性的，虽然效力较弱的FGFR1酪氨酸激酶活性抑制剂，Ki值为0.83μM。除了这三种结构相关的裂解激酶结构域RTK之外，还针对一组额外的酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸激酶评估了舒尼替尼的活性。

在这些生物化学分析中，舒尼替尼的IC50值通常比Flk-1和PDGFR的IC50值高至少10倍（例如，对于EGFR和Cdk2，IC50值>>10μM;对于Met为4μM;对于IGFR-为2.4μM1;Abl为0.8μM;Src为0.6μM[2]。在RS4;11细胞（FLT3-WT）中，用舒尼替尼（SU11248）处理以剂量依赖性方式抑制FLT3-WT磷酸化，IC5​​0为约250nM。在MV4;11个表达FLT3-ITD的细胞中，舒尼替尼以剂量依赖性方式抑制FLT3-ITD磷酸化，治疗2小时后IC50为50nM[3]。

舒尼替尼抑制VEGF诱导的血清饥饿处理的HUVECs增殖，IC50为40nM，且抑制PDGF诱导的过量表达PDGFRβ或PDGFRα的NIH-3T3细胞，IC50分别为39nM和69nM。舒尼替尼抑制野生型FLT3（IC50：250nM），FLT3-ITD（IC50：50nM）和FLT3-Asp835磷酸化（30nM）。舒尼替尼作用于血清饥饿处理的表达VEGFR2或PDGFRβ的NIH-3T3细胞，抑制VEGF依赖的VEGFR2磷酸化和PDGF依赖的PDGFRβ磷酸化，IC50分别为10nM和10nM。舒尼替尼是VEGFR2（Flk1）和PDGFRβ的强效ATP竞争性抑制剂，Ki分别为9nM和8nM。

2）体内活性
苹果酸舒尼替尼具有非常好的口服生物利用度，在许多临床前肿瘤模型中非常有效，并且在有效剂量下具有良好的耐受性[1]。舒尼替尼（80mg/kg/天）抑制无胸腺小鼠中已建立的SF763T和Colo205肿瘤异种移植物的生长。舒尼替尼（SU11248）治疗有效抑制已建立的肿瘤异种移植物的生长[2]。苹果酸舒尼替尼是VEGFR，PDGFR，FGFR的抑制剂，并且用于治疗晚期肾细胞癌和胃肠道间质瘤。苹果酸舒尼替尼处理的大鼠比未处理的大鼠显示出更低的肿瘤生长水平，并且它们的肿瘤具有更小的坏死区域和更低的血管密度[4]。

每天用20mg/kg舒尼替尼处理，明显阻断皮下MV4;11(FLT3-ITD)移植瘤增长。用每天80mg/kg舒尼替尼处理，持续21天，八只鼠中有六只肿瘤完全衰退，且处理结束后观察110天，肿瘤没有复发。与体内大量且选择性抑制VEGFR2或PDGFR磷酸化和信号相一致。每天20-80mg/kg舒尼替尼处理HT-29，A431，Colo205，H-460，SF763T，C6，A375或MDA-MB-435移植瘤模型，发现其抗癌活性广泛，这种作用存在剂量依赖性。舒尼替尼处理SF763T胶质瘤，肿瘤MVD明显降低40%。SU11248处理，完全抑制表达荧光素酶的PC-3M移植瘤的生长，而肿瘤尺寸没有减小。

二、苹果酸舒尼替尼的活性实验方法：
1）动物实验

小鼠[2]-使用雌性nu/nu小鼠（8-12周龄，25g）。简而言之，皮下植入3-5×106个肿瘤细胞。在第0天进入小鼠的后腹侧区域。一旦肿瘤达到指定的平均大小，开始口服施用SU11248作为羧甲基纤维素悬浮液或作为柠檬酸盐缓冲（pH3.5）溶液的荷瘤小鼠的每日治疗。基于每周两次的肿瘤体积测量来评估肿瘤生长。通常，当载体处理的动物中的肿瘤达到1000mm3的平均大小或当判断肿瘤对动物的健康有不利影响时，终止研究。

大鼠[4]
使用40只雌性Sprague-Dawley大鼠（200-230g）。每组由5-10只随意喂食的动物组成。在气体麻醉（2％异氟烷）下，将1×104Walker256细胞注入左腹部乳腺脂肪垫中。每天称重大鼠并通过管饲法给予苹果酸舒尼替尼（30mg/kg）和/或芬戈莫德（5mg/kg）橄榄油。用卡尺测量肿瘤。在肿瘤溃疡之前，通过心内注射氯胺酮（50mg/mL）麻醉并杀死动物。解剖大鼠以检测肺，肝，肾或肠转移。

2）细胞实验
RS4;11和MV4;11个细胞系在加入SU11248（1nM，5nM，10nM，25nM，75nM，100nM，250nM，500nM）和FL之前在含有0.1％FBS的培养基中饥饿过夜。（50ng/mL;仅FLT3-WT细胞）。如制造商所述，对于每种条件，使用AlamarBlue测定法在培养48小时后测量增殖，每种条件一式三份。台盼蓝细胞活力测定平行进行并产生类似的结果[3]。

3）激酶实验
生化酪氨酸激酶测定：使用含有RTK的完整细胞质结构域的谷胱甘肽S-转移酶蛋白测定舒尼替尼对VEGFR2（Flk-1）和PDGFRβ的IC50值。用于定量VEGFR2（Flk-1）和PDGFRβ的反式磷酸化活性的生化酪氨酸激酶测定在96孔微量滴定板中进行，所述96孔微量滴定板预涂覆（在PBS中20μg/孔;在4℃温育过夜），与肽底物聚-Glu，Tyr（4：1）。通过在PBS中添加1-5％（w/v）BSA来阻断过量的蛋白质结合位点。纯化的GST-融合蛋白在杆状病毒感染的昆虫细胞中产生。然后将GST-VEGFR2和GST-PDGFRβ加入到由100mMHEPES，50mMNaCl，40μMNaVO4和0.02％（w/v）BSA组成的2x浓度激酶稀释缓冲液中的微量滴定孔中。GST-VEGFR2或GST-PDGFRβ的最终酶浓度为50ng/mL。

随后将25μL稀释的舒尼替尼加入每个反应孔中以产生适合于每种酶的一系列抑制剂浓度。通过在MnCl2溶液中加入不同浓度的ATP引发激酶反应，使得最终的ATP浓度跨越酶的Km，并且MnCl2的最终浓度为10mM。将板在室温下温育5-15分钟，然后加入EDTA终止反应。然后用TBST将板洗涤三次。将兔多克隆抗磷酸酪氨酸抗血清以1：10,000稀释度加入到含有0.5％（w/v）BSA，0.025％（w/v）脱脂奶粉和100μMNaVO4的TBST中，并在37°温育1小时。C。然后将板用TBST洗涤三次，接着加入与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗兔抗血清（在TBST中1：10,000稀释）。将板在37℃温育1小时，然后用TBST洗涤三次。在加入2,2'-连氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐]作为底物后，定量每孔中磷酸酪氨酸的量。

综上所述：苹果酸舒尼替尼是一种有效的酪氨酸激酶抑制剂，抑制VEGFR2和PDGFRβ的IC50分别为80nM和2nM。它的靶点活性为FGFR1,2.9μM；PDGFRβ,2nM；VEGFR2,80nM。

参考文献：
[1]. Sun L, et al. Discovery of 5-[5-fluoro-2-oxo-1,2- dihydroindol-(3Z)-ylidenemethyl]-2,4- dimethyl-1H-pyrrole-3-carboxylic acid (2-diethylaminoethyl)amide, a novel tyrosine kinase inhibitor targeting vascular endothelial and platelet-derived growth factor r
[2]. Mendel DB, et al. In vivo antitumor activity of SU11248, a novel tyrosine kinase inhibitor targeting vascular endothelial growth factor and platelet-derived growth factor receptors: determination of a pharmacokinetic/pharmacodynamic relationship. Clin Can
[3]. O'Farrell AM, et al. SU11248 is a novel FLT3 tyrosine kinase inhibitor with potent activity in vitro and in vivo. Blood. 2003 May 1;101(9):3597-605.
[4]. Mousseau Y, et al. Fingolimod potentiates the effects of sunitinib malate in a rat breast cancer model. Breast Cancer Res Treat. 2012 Jul;134(1):31-40.
[5]. Small J, et al. The addition of abemaciclib to sunitinib induces regression of renal cell carcinoma xenograft tumors. Oncotarget. 2017 Jul 27;8(56):95116-95134.