多韦替尼的作用和生物活性

多韦替尼（TKI258，CHIR258）是一种多靶点RTK抑制剂，主要用于III类（FLT3/c-Kit，IC50：1/2nM），对IV类（FGFR1/3）和V类（VEGFR1-4）RTK也有效。（IC50：8-13nM），对EGFR，InsR，EphA2，c-Met，IGF-1R，Tie2和HER2的效力较低。

一、多韦替尼的生物活性详解：
1）体外活性
多韦替尼有效抑制FGF刺激的WT和F384L-FGFR3表达B9细胞的生长，IC50值为25nM。B9-MINV细胞在高达1μM的浓度下对多韦替尼的抑制活性具有抗性。多韦替尼抑制KMS11（FGFR3-Y373C），OPM2（FGFR3-K650E）和KMS18（FGFR3-G384D）细胞的细胞增殖，IC50值分别为90nM（KMS11和OPM2）和550nM[1]。多韦替尼显着降低SK-HEP1和21-0208细胞中FGFR-1，FGFR底物2α（FRS2-α）和ERK1/2的基础磷酸化水平，但不显着降低Akt[2]。多韦替尼增强BMP-2诱导的碱性磷酸酶（ALP）诱导，这是成骨细胞分化的代表性标志物。

多韦替尼还可以刺激磷酸化Smad1/5/8向细胞核的转位和丝裂原活化蛋白激酶的磷酸化，包括ERK1/2和p38[3]。多韦替尼强烈抑制TNIK与ATP（Ki，13nM）的相互作用和Wnt信号传导因子如β-catenin和TCF4的激活。多韦替尼还诱导IM-9细胞中的caspase依赖性细胞凋亡，而在PBMC中没有显着的细胞毒性[4]。

2）体内活性
多韦替尼（10mg/kg，30mg/kg，60mg/kg，po）在携带KMS11的小鼠模型中显示出显着的抗肿瘤作用，10mg/ml的生长抑制率为48％，78.5％和94％与安慰剂治疗的小鼠相比，分别为kg，30mg/kg和60mg/kg治疗组[1]。多韦替尼（50和75mg/kg）分别导致97％和98％的肿瘤生长抑制，最大疗效为50mg/kg[2]。

二、多韦替尼的活性实验方法：
1）动物实验
如前所述制备异种移植小鼠模型。简而言之，将6至8周龄雌性BNX小鼠皮下接种于右侧腹部，在150μLIMDM中加入3×107KMS11细胞，以及150μL基质胶基底膜基质。当肿瘤达到200mm3的体积时开始治疗，此时小鼠随机接受10,30或60mg/kg多韦替尼或5mM柠檬酸盐缓冲液。通过强饲法每天给药21天。每个治疗组包括8至10只小鼠。每周两次进行卡尺测量以估计肿瘤体积，使用以下公式：4π/3×（宽度/2）2×（长度/2）。单因素方差分析用于比较载体和多韦替尼治疗组之间的差异。

2）细胞实验
根据制造商的说明，通过3-（4,5-二甲基噻唑）-2,5-二苯基四唑（MTT）染料吸光度评估细胞活力。将细胞以每孔5000个（B9细胞）或20000个（MM细胞系）细胞的密度接种在96孔板中。将细胞与30ng/mLaFGF和100μg/mL肝素或1％IL-6一起孵育，其中指示并增加浓度的多韦替尼。对于每种浓度的多韦替尼，加入在培养基中稀释的10-μL等分试样的药物或DMSO。对于药物组合研究，将细胞与0.5μM地塞米松，100nM多韦替尼或两者同时孵育。

为了评估多韦替尼对粘附于BMSC的MM细胞生长的影响，在存在或不存在多韦替尼的情况下，在BMSC包被的96孔板上培养10000个KMS11细胞。将板孵育48至96小时。为了评估巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）介导的生长，将5000M-NFS-60细胞/孔与连续稀释的CHIR-25ZS8与10ng/mLM-CSF一起孵育，没有粒细胞-巨噬细胞集落-刺激因子（GM-CSF）。72小时后，使用CellTiter-GloAssay测定细胞活力。每个实验条件一式三份进行。

3）激酶实验
用时间分辨荧光（TRF）或放射性形式测定多韦替尼抑制RTK的50％抑制浓度（IC50）值，测量多韦替尼通过相应酶将磷酸盐转移到底物上的抑制。在50mMHEPES（N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸），pH7.0,2mMMgCl2,10mMMnCl21mM中测定FGFR3，FGFR1，PDGFR-β和VEGFR1-3的激酶结构域。NaF，1mM二硫苏糖醇（DTT），1mg/mL牛血清白蛋白（BSA），0.25μM生物素化肽底物（GGGGQDGKDYIVLPI）和1至30μM三磷酸腺苷（ATP），取决于各酶的Km。ATP浓度等于或略低于Km。

对于c-KIT和FLT3反应，在0.25至1μM生物素化的肽底物（GGLFDDPSYVNVQNL）存在下，用0.2至8μMATP将pH升至7.5。将反应物在室温下温育1至4小时，并在含有终止反应缓冲液（25mMEDTA[乙二胺四乙酸]，50mMHEPES，pH7.5）的链霉抗生物素蛋白包被的微量滴定板上捕获磷酸化肽。使用铕标记的抗磷酸酪氨酸抗体PT66，用DELFIATRF系统测量磷酸化肽。使用XL-Fit数据分析软件4.1版，使用非线性回归计算多韦替尼对IC50的浓度。使用IC50ProfilerExpress服务确定集落刺激因子-1受体（CSF-1R），PDGFR-α，胰岛素受体（InsR）和胰岛素样生长因子受体1（IGFR1）激酶活性的抑制。

综上所述：多韦替尼是多靶点的酪氨酸激酶抑制剂，抑制FLT3，c-Kit，FGFR1/3，VEGFR1/2/3和PDGFRα/β的IC50值分别为1，2，8/9，10/13/8，27/210nM。它的靶点活性为c-Kit,2nM；FGFR1,8nM；FGFR3,9nM；FLT3,1nM；VEGFR3/FLT4,8nM。

参考文献：
[1]. Trudel S, et al. CHIR-258, a novel, multitargeted tyrosine kinase inhibitor for the potential treatment of t(4;14) multiple myeloma. Blood. 2005, 105(7), 2941-2948.
[2]. Huynh H, et al. Dovitinib demonstrates antitumor and antimetastatic activities in xenograft models of hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 2012, 56(3), 595-601.
[3]. Lee Y, et al. A Receptor Tyrosine Kinase Inhibitor, Dovitinib (TKI-258), Enhances BMP-2-Induced Osteoblast Differentiation In Vitro. Mol Cells. 2016 May 31;39(5):389-94
[4]. Chon HJ, et al. Traf2- and Nck-interacting kinase (TNIK) is involved in the anti-cancer mechanism of dovitinib in human multiple myeloma IM-9 cells. Amino Acids. 2016 Jul;48(7):1591-9.