利尼伐尼(ABT-869)的作用和生物活性

利尼伐尼（ABT-869）是一种新型，有效的ATP竞争性VEGFR/PDGFR抑制剂，用于KDR（IC50：4nM），CSF-1R（IC50：3nM），Flt-1/3（IC50：3/4nM）和PDGFRβ（IC50：66nM）。它可能对肿瘤细胞表现出有效的抗增殖和凋亡作用，其增殖依赖于突变激酶，如FMS相关的酪氨酸激酶受体-3（FLT3）。那么它的生物活性是什么？如何做实验呢？下面让小编给您详细说明。

首先我们介绍利尼伐尼的生物活性：
1）体外活性
对于VEGF和PDGF受体家族的成员，利尼伐尼显示IC50值范围为4nM（KDR）至190nM（FLT4）。利尼伐尼对TIE2和RET的作用较小，但对其他非相关酪氨酸激酶（如类固醇受体辅激活因子和表皮生长因子受体）的活性较低（IC50>10μM）。利尼伐尼抑制由VEGF诱导的KDR的磷酸化，在工程化表达人KDR的3T3鼠成纤维细胞中IC50为4nM。

利尼伐尼对血管内皮生长因子-刺激的人脐动脉内皮细胞增殖有抑制作用（IC50：0.2nM）。在激酶实验中，利尼伐尼抑制Kit（IC50：14nM）、PDGFRβ（IC50：66nM）和Flt4（IC50：190nM）。利尼伐尼也抑制细胞水平配体诱导的KDR（IC50：2nM）、PDGFR-β（IC50：2nM）、KIT（IC50：31nM）和CSF-1R（IC50：10nM）磷酸化，血清蛋白可影响该效力。

当HUAEC用作靶细胞时，使用利尼伐尼可以看到抑制受体自身磷酸化的类似效力。利尼伐尼在10nM时完全抑制VEGF刺激的KDR磷酸化，在3nM时抑制60％（IC50=2nM）[1]。在Ba/F3FLT3ITD细胞中，利尼伐尼（10nM）降低Akt在Ser473位点磷酸化及GSK3β在Ser9位点磷酸化。然而，ABT-869几乎不影响不受血管内皮生长因子或血小板衍生因子诱导的肿瘤细胞，除MV4-11白血病细胞(具有组成型活性形式Flt3，IC50：4nM)。利尼伐尼可与CSF-1R的ATP结合位点结合（Ki：3nM）。

2）体内活性

利尼伐尼在VEGF诱导的子宫水肿（ED50=0.5mg/kg）和角膜血管生成（>50％抑制，15mg/kg）的基于机制的鼠模型中有效口服。ABT-869在人纤维肉瘤和乳腺癌，结肠癌和小细胞肺癌异种移植模型（ED50=1.5-5mg/kg，每天两次）中显示出功效，并且在原位乳腺和神经胶质瘤模型中也是有效的（>50％抑制）。分别在表皮样癌和白血病异种移植模型中观察到肿瘤大小减小和肿瘤消退[1]。

在肺组织中，利尼伐尼（0.3mg/kg）使血管内皮生长因子受体磷酸化被完全抑制。在角膜上，每天两次利尼伐尼（7.5/15mg/kg）显著抑制重组碱性成纤维细胞生长因子-和血管内皮生长因子诱导的血管生成。在MDA-231移植瘤中，利尼伐尼（12.5mg/kg，2次/天）可降低微脉管密度。利尼伐尼也抑制水肿反应（ED50：0.5mg/kg）。作用于移植瘤模型，包括HT1080,H526,MX-1和DLD-1时，利尼伐尼抑制肿瘤生长（ED75：4.5-12mg/kg）。作用于在HT1080纤维肉瘤模型中，利尼伐尼的Cmax和AUC24小时分别为0.4μg/mL和2.7μg·hour/mL。

我们已经了解了它的生物活性，接下来如何做活性实验呢？一般来说，有如下的三种方法：

1）动物实验
鼠：将携带肿瘤的动物分成组（n=10），并开始以指定剂量给予载体（2％乙醇，5％吐温80,20％PEG400,73％盐水）或抑制剂（利尼伐尼）。通过用卡尺测量肿瘤大小和计算大小来评估侧腹中的肿瘤生长。使用磁共振成像[1]确定原位胶质瘤模型的肿瘤体积。

2）细胞实验
将细胞以每孔2.5×103接种到96孔板中，并与无血清培养基一起温育24小时。加入利尼伐尼和VEGF（最终，10ng/mL）并在无血清培养基中温育72小时。对于癌细胞系，将3×103个细胞/孔在完全生长培养基中过夜接种。在完全生长培养基中将利尼伐尼加入细胞中并孵育72小时。对于白血病细胞，通常将5×104每孔接种在完全生长培养基中，加入利尼伐尼，并培养72小时。通过添加AlamarBlue（最终溶液，10％），在37℃下在CO2培养箱中孵育4小时并在荧光板读数器中分析（544nm，激发：590nm，发射（仅）来确定对增殖的影响。）

3）激酶实验
激酶测定：通过使用FastBacbaculovirus表达系统克隆并在杆状病毒中表达或商业获得的活性激酶结构域的测定来确定效力（IC50值）。对于酪氨酸激酶测定，含有单一酪氨酸的生物素化肽底物与1mMATP，Eu-穴状化合物标记的抗磷酸酪氨酸抗体（PT66）和链霉亲和素-APC一起用于均相时间分辨荧光测定。使用5μMATP，[33P]ATP和具有肽捕获的生物素化肽底物测定丝氨酸/苏氨酸激酶，并使用SA-Flashplate测定33P的掺入。通过连续稀释利尼伐尼的DMSO储备溶液制备多种浓度的利尼伐尼。使用浓度响应数据的非线性回归分析计算导致50％活性抑制的浓度。

今天介绍了利尼伐尼的作用，并且详细地说明了它的生物活性和实验方法。小编给您做一个总结：利尼伐尼(ABT-869)是一种多靶点VEGF和PDGFR受体家族的抑制剂，抑制KDR，Flt-1，PDGFRβ和FLT3的IC50值分别为3，4，66，4nM。它的靶点活性为CSF-1R,3nM；FLT3,4nM；Kit,14nM；VEGFR1/FLT1,3nM；VEGFR2/KDR,4nM。

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参考文献：
[1]. Albert DH, et al. Preclinical activity of ABT-869, a multitargeted receptor tyrosine kinase inhibitor. Mol Cancer Ther, 2006, 5(4), 995-1006.