星孢菌素的作用 - 生物活性 - 靶点活性

星孢菌素，别名是星形孢菌素，英文名Staurosporine，它是PKCα/γ/η的有效PKC抑制剂（IC50：2/5/4 nM），对PKCε（73 nM），PKCδ（20 nM）的效力较低，对PKCζ的作用很小（1086 nM）。那么它的生物活性是什么？如何做实验呢？下面让小编给您详细说明。

首先我们介绍星孢菌素的生物活性：

1）体外活性
星孢菌素广泛用作具有广谱活性的蛋白激酶C（PKC）抑制剂，是从Streptomyces staurospores的培养液中分离的生物碱。MC3T3E-1成骨细胞暴露于星孢菌素（100 nM）12 h，释放出与对照细胞释放相似的LDH（12.4±3.1％）（10.0±2.4％），表明裂解相对缺失 死亡，发生在坏死。此外，用星形孢菌素（100nM）处理导致形态学变化，细胞凋亡的特征：在Hoechst 33258染色后通过荧光显微镜观察到的亮蓝色荧光凝聚核，并且细胞体积减少[2]。

2）体内活性
星孢菌素的抑制作用在肿瘤促进的Wk10左右具有统计学意义。尽管在实验的后几周中10ng的星形孢菌素没有获得统计学上显着的抑制，但是带有肿瘤的小鼠的百分比和每只小鼠的平均肿瘤数量的下降趋势是明显的。因此，星孢菌素稍微抑制了Teleocidin的肿瘤促进，即使在星孢菌素本身诱发肿瘤的剂量[3]。即使在病变后2周开始给药，Staurosponne（0.05和0.1 mg / kg腹膜内）减弱了水迷宫和被动回避任务的受损性能。此外，星孢菌素（0.1 mg / kg）可部分逆转由基底前脑损伤引起的额顶皮质中胆碱乙酰转移酶活性的降低。这些结果表明，星孢菌素通过逆转基底前脑损伤诱导的胆碱能神经元损伤减轻了学习障碍[4]。

我们已经了解了星孢菌素的生物活性，接下来如何做活性实验呢？一般来说，有如下的三种方法：

1）动物实验
小鼠[3]-使用雌性CD-1小鼠。将10μL丙酮中的各种量的星形孢菌素施用于8周龄CD-1小鼠的耳朵。刺激程度表示为引起刺激的化合物的最小剂量。小鼠皮肤中HOC的诱导将0.1mL丙酮中的星形孢菌素施用于CD-1小鼠背部的皮肤，18小时后从皮肤获得粗酶提取物。 HDC活性表示为每1小时孵育每mg蛋白质释放的CO2的pmol。诱导小鼠皮肤中的ODC将0.2mL丙酮中的星形孢菌素施用于CD-1小鼠背部的皮肤。 4小时后，从表皮制备粗酶提取物，并测量其ODC活性。酶活性表示为每30分钟孵育每mg蛋白质的nmol CO2。

大鼠[4]-使用雄性Kbl Wistar大鼠（体重270至310g）。在给予星形孢菌素2周的组中，在BF损伤后2周开始水迷宫任务和星形孢菌素给药，并且在BFlesion后4周进行被动回避任务。在水迷宫训练期间和被动回避任务采集之前30mm，大鼠接受剂量为0.01,0.03,0.1和0.3mg / kg（每组i.p.，N = 10，持续2周）的星形孢菌素。在给予星形孢菌素4周的组中，首先在BF损伤后2周给予药物。水迷宫任务在BF病变后4周进行。被动回避任务在BF病变后6周进行。大鼠在训练前每天一次接受0.05,0.1和0.2mg / kg（每组ip，N = 10）的星孢菌素，持续2周，在水迷宫训练和被动回避任务获取试验后持续2周。 星孢菌素悬浮在0.3％的羧甲基纤维素钠中。将载体以与星形孢菌素处理的动物相同的方案施用于未损伤的对照和损伤的对照。

2）细胞实验
将细胞暴露于星形孢菌素约32小时。将细胞固定在4％多聚甲醛中并用DNA结合染料Hoechst 33342染色。在落射荧光照射下观察细胞，并测定凋亡细胞（具有浓缩和片段化DNA的细胞）的百分比。

3）激酶实验
将MC3T3E-1细胞（2×10 6个细胞/组）用100nM星形孢菌素处理不同的时间段并在裂解缓冲液中裂解（EB缓冲液：1％Triton X-100,10mM Tris，pH 7.6,50mM NaCl， 1mg / mL抑肽酶，5mM EDTA，50mM NaF，0.1％2-巯基乙醇和100μM原钒酸钠）。将细胞裂解物在12000g，4℃下离心30分钟。收集可溶性级分并与抗JNK1抗体一起温育。在冰上孵育3小时后，将100μL10％福尔马林固定的金黄色葡萄球菌溶液加入到抗JNK1免疫沉淀物中，并进一步在冰上孵育1小时。用EB缓冲液和PAN缓冲液（10mM PIPES缓冲液，pH7.0,1％抑肽酶，100mM NaCl）洗涤吸收的免疫复合物两次。

将免疫复合物与2μgGST-c-Jun NT1-79蛋白混合，在30μL含有2μM冷ATP，2 mM DTT，20 mMMgCl2,2μCi[γ33-P] -ATP的反应缓冲液中作为底物和20mM Tris-HCl，pH 7.5,30℃，20分钟。通过加入15μL3×SDS-PAGE样品缓冲液并在98℃下煮沸5分钟终止反应。蛋白质在12％SDS-PAGE上分离，并通过半干电转移系统转移到硝酸纤维素膜上。用兔抗JNK1抗体和辣根过氧化物酶缀合的抗兔抗体对膜进行免疫印迹，以显现通过增强的化学发光系统测量的信号。将凝胶在真空下干燥，通过放射自显影观察磷酸转移酶活性，并通过PhosphoImager分析仪定量[2]。

今天介绍了星孢菌素的作用，并且详细地说明了它的生物活性和实验方法。综上所述，星孢菌素Staurosporine是一种有效，非选择性蛋白激酶抑制剂，抑制PKC，PKA，c-Fgr，和Phosphorylase kinase的IC50分别为6 nM，15 nM，2 nM，3 nM。星孢菌素的靶点活性为c-Fgr,2nM；PKC,3nM；PKCα,2nM；PKCγ,5nM；PKCη,4nM。

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参考文献：
[1]. Meggio F, et al. Different susceptibility of protein kinases to staurosporine inhibition. Kinetic studies and molecular bases for the resistance of protein kinase CK2. Eur J Biochem. 1995 Nov 15;234(1):317-22.
[2]. Chae HJ, et al. Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts. Pharmacol Res. 2000 Oct;42(4):373-81.
[3]. Yoshizawa S, et al. Tumor-promoting activity of staurosporine, a protein kinase inhibitor on mouse skin.Cancer Res. 1990 Aug 15;50(16):4974-8.
[4]. Nabeshima T, et al. Staurosporine facilitates recovery from the basal forebrain-lesion-induced impairment of learning and deficit of cholinergic neuron in rats. J Pharmacol Exp Ther. 1991 May;257(2):562-6.