恩替诺特-作用-生物活性-恩替诺特靶点活性

恩替诺特，英文名Entinostat，别名MS-275或者SNDX-275。它是HDAC1和HDAC3的有效抑制剂。恩替诺特对HDAC1和HDAC3的IC50分别为0.51μM和1.7μM。那么它的生物活性是什么？如何做实验呢？下面让小编给您详细说明。

首先我们介绍恩替诺特的生物活性：

1）体外活性
恩替诺特（MS-275）对HDAC1和HDAC2的结合亲和力分别为282 nM和156 nM [1]。已经在人白血病和淋巴瘤细胞（U937，HL-60，K562和Jurkat）以及与分化和凋亡相关的原代急性髓性白血病母细胞中检测了HDAC抑制剂恩替诺特（MS-275）的作用。MS-275在每种细胞系中显示剂量依赖性效应。当以低浓度（例如，1μM）施用时，MS-275表现出有效的抗增殖活性，诱导p21CIP1 / WAF1介导的生长停滞和U937细胞中分化标志物（CD11b）的表达。恩替诺特（MS-275）有效诱导细胞死亡，48小时内在~70％的细胞中引发细胞凋亡[2]。

在K562细胞中，MS-275诱导p21WAF1/CIP1和凝溶胶蛋白的累积。在A2780细胞中，MS-275能够降低S期细胞，提高G1期细胞。在U937细胞中，MS-275可以诱导p21CIP1/WAF1 调节的生长和变异Marker (CD11b)的表达。

2）体内活性
49mg / kg的恩替诺特（MS-27-275）显示出对KB-3-1,4-1St和St-4肿瘤系的显着抗肿瘤作用，并且对Capan-1肿瘤具有中等作用。24.5mg / kg和12.3mg / kg的恩替诺特也显示出对这些肿瘤的显着作用。此外，口服恩替诺特显着增加了给药后4-24小时HT-29肿瘤异种移植物中组蛋白乙酰化的水平[3]。MS-275给予实验性自身免疫性神经炎（EAN）大鼠每天一次出现第一次神经系统体征，大大降低了EAN的严重程度和持续时间，减弱了巨噬细胞，T细胞和B细胞的局部积聚，以及脱髓鞘坐骨神经此外，在MS-275处理的EAN大鼠的坐骨神经中观察到促炎性白细胞介素-1β，干扰素-γ，白细胞介素-17，诱导型一氧化氮合酶和基质金属蛋白酶-9的mRNA水平的显着降低。此外，MS-275处理增加了EAN大鼠坐骨神经中渗入的Foxp3 +细胞和抗炎M2巨噬细胞的比例[4]。

我们已经了解了恩替诺特的生物活性，接下来如何做活性实验呢？一般来说，有如下的三种方法：

1）细胞实验
将SH-SY5Y细胞保持在正常培养条件下，在37℃，5％CO 2的潮湿培养箱中，每周分开两次。将细胞以2500个细胞/孔接种在黑色384孔板中，在20-μL体积的补充有10％FBS的DMEM / F-12培养基中，并使其粘附过夜。第二天，将HDAC抑制剂（例如，Entinostat）在100％DMSO中连续稀释，然后将该系列交叉稀释到培养基中。

将在培养基中稀释的5μL化合物（例如，Entinostat）加入到细胞板的适当孔中，得到指示的最终浓度的抑制剂（例如，Entinostat）和最终的0.1％DMSO。在定量细胞ATP水平之前，将处理过的细胞在正常组织培养条件下孵育6,24,48,72或96小时，如使用CellTiter-Glo试剂测量的。

类似地，在与HDAC抑制剂（例如，Entinostat）温育6小时后，吸出来自分开的细胞板的培养基，并用不含抑制剂的培养基洗涤细胞一次。将补充有10％FBS和0.1％DMSO（无抑制剂）的25μL培养基加回细胞，并在孵育24,48,72或96小时后使用CellTiter-Glo测定细胞ATP水平。使用具有0.1秒计数时间的Envision仪器在每个时间点测量发光[1]。

2）动物实验
小鼠[3]-将A2780细胞（9×106）悬浮于PBS中，并皮下注射到裸鼠的侧腹中。对于其他肿瘤系，KB-3-1，HCT-15,4-1St，Calu-3，St-4，Capan-1和HT-29，肿瘤在开始体内抗肿瘤测试前传代数次，并且通过使用套管针将肿瘤块（直径2-3mm）皮下移植到裸鼠的侧腹中。在确认肿瘤在体内生长（肿瘤大小，20-100mm 3）后，开始用药物治疗（每个实验组中有4或5只小鼠）。恩替诺特每周口服给药一次，每周5天，持续4周。每周两次监测肿瘤长度和宽度，并计算肿瘤体积。

大鼠[4]-将雄性Lewis大鼠（8-10周，170-200g）饲养在12小时光照/黑暗循环中，自由获取食物和水。对于治疗性治疗，EAN大鼠接受腹膜内注射。从第10天至第14天每天注射MS-275（3.5mg / kg）（6只大鼠/组）。对于注射，将MS-275悬浮在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，并向对照大鼠施用相同体积（1mL）的PBS。

3）激酶实验
通过Nanosyn在384孔微量培养板中以10μL的反应体积进行HDAC活性的生化测定。标准酶促反应含有5μL2×HDAC抑制剂（如Entinostat），4μL2.5×酶和1μL10×底物的分析缓冲液（100 mM HEPES，pH 7.5,25 mM KCl，0.1％BSA） ，0.01％Triton X-100,1％DMSO）。酶促测定中所有HDAC的最终浓度为0.5至5nM。在所有测定中使用1μMFAM-RHKK（Ac）-NH2或FAM-RHKK（三氟乙酰基）-NH2的最终底物浓度，发现低于每种酶的测定Km，app [1]。

今天介绍了恩替诺特的作用，并且详细地说明了它的生物活性和实验方法。综上所述，恩替诺特Entinostat是选择性，可口服的 HDAC class I 抑制剂，抑制 HDAC1，HDAC2 和 HDAC3 的 IC50 分别为 243 nM，453 nM 和 248 nM。它的靶点活性是HDAC1,0.51μM；HDAC3,1.7μM。

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参考文献：
[1]. Lauffer BE, et al. Histone deacetylase (HDAC) inhibitor kinetic rate constants correlate with cellular histone acetylation but not tranion and cell viability. J Biol Chem. 2013 Sep 13;288(37):26926-43.
[2]. Rosato RR, et al. The histone deacetylase inhibitor MS-275 promotes differentiation or apoptosis in human leukemia cells through a process regulated by generation of reactive oxygen species and induction of p21CIP1/WAF1 1. Cancer Res. 2003 Jul 1;63(13):36
[3]. Saito A, et al. A synthetic inhibitor of histone deacetylase, MS-27-275, with marked in vivo antitumor activity against human tumors. Proc Natl Acad Sci U S A, 1999, 96(8), 4592-4597.
[4]. Zhang ZY, et al. MS-275, an histone deacetylase inhibitor, reduces the inflammatory reaction in rat experimental autoimmune neuritis. Neurosci, 2010, 169, 370-377.