叶绿素的提取和分离实验步骤是什么？

叶绿素，是高等植物和其它所有能进行光合作用的生物体含有的一类绿色色素。叶绿素a 和叶绿素b 均可溶于乙醇、乙醚和丙酮等溶剂，不溶于水，因此，可以用极性溶剂如丙酮、甲醇、乙醇、乙酸乙酯等提取叶绿素。

提取步骤：
叶绿素提取的准备工作是在一个半暗的房间里，室温保持在25℃。提取步骤如下：
(1) 取1000克新鲜的绿叶，在韦氏搅切器中粉碎。
(2)将粉碎的1000克绿叶放进加有少量的碳酸钙的丙酮中(温度20℃)进行萃取，直到过滤、清洗后的叶子碎片为无色。
(3)将过滤后的丙酮提取液放到盛有1升石油醚和100ml丙酮的漏斗中，然后轻轻地旋转，同时加放蒸馏水直到分层为止。水层的大部分丙酮和水溶杂质被丢弃，只剩石油醚溶液。
(4)将石油醚溶液用蒸馏水再次净化后，用含有石油醚和0.01克草酸的200ml80%的甲醇溶液清洗5次以上，最后得到黄绿色悬浮液。
(5)用无水硫酸钠对悬浮液进行干燥，并将其渗入到3cm厚的蔗糖粉末制成柱中，然后用石油醚清洗沉淀的色素去掉类胡萝卜素，使之只含有天然的叶绿素。
(6)含有天然叶绿素的蔗糖柱分两层，绿层有4-10mm的叶绿素b层，另一蓝层为2-6mm的叶绿素a层。
(7)将位于蓝层正中的部分(约占蓝层的一半) 放入醚中，对此悬浮液进行过滤、洗提，用蒸馏水清洗，用硫酸钠干燥，再用器皿进行过滤后，得到叶绿素a。
(8)将(6)中的绿层中间部分移出，迅速放入醚中过滤、洗提，制成叶绿素b醚溶液。

分离
色谱法是一种很好的分离纯化、鉴定有机化合物的重要方法，尤其是在微量分析中应用的更是广泛。果蔬中色素主要包括脂溶性的胡萝卜素、叶黄素、叶绿素和水溶性的花青素。在提取实验时，我们可以利用相似相溶的原理把水溶性的花青素滤掉，继而可以利用薄层色谱、柱色谱、高效液相色谱对胡萝卜素、叶黄素和叶绿素进行分离，由于这三种色素的极性依次减弱，可以适当地选择单一的有机溶剂或者不同配比的混合溶剂作为展开剂和洗脱剂，确定最佳的优化分离条件。

具体的实验步骤如下：

一 实验目的
1．掌握提取叶绿素的方法；
2．了解薄层层析的原理，掌握薄层层析的一般操作和定性鉴定方法

二 实验原理
1．叶绿素提取
高等植物体内的叶绿体色素有叶绿素和类胡萝卜素两类，主要包括叶绿素a (C55H72O5N4Mg)、叶绿素b(C55H70O6N4Mg)、β—胡萝卜素(C40H56)和叶黄素(C40H56O2)等4种。叶绿素a和叶绿素b为吡咯衍生物与金属镁的配合物，胡萝卜素是一种橙色天然色素，属于四萜类，为一长链共轭多烯，有α、β、γ三种异构体，其中，β异构体含量最多。叶黄素为一种黄色色素，与叶绿素同存在于植物体中，是胡萝卜素的羟基衍生物，较易溶于乙醇，在乙醚中溶解度较小。根据它们的化学特性，可将它们从植物叶片中提取出来，并通过萃取、沉淀和色谱方法将它们分离开来。

2．薄层色谱
薄层层析是快速分离和定性分析微量物质的一种极为重要的实验技术，具有设备简单、操作方便而快速的特点。它是将固定相支持物均匀地铺在玻片上制成薄层板，将样品溶液点加在起点处，置于层析容器中用合适的溶剂展开而达到分离的目的。用此法分离时几乎不受温度的影响，可采用腐蚀性显色剂，而且可在高温下显色，特别适用于挥发性小或在较高温度下易发生反应的物质，同时也常用来跟踪有机反应或监测有机反应完成的程度。
薄层层析的器材选择：

（1）基板：玻璃、塑料、金属箔，常用玻璃板。

（2）吸附剂：
吸附剂要有合适的吸附力，并且必须与展开剂和被吸附物质均不起化学反应。可用作吸附剂的物质很多，常用的有硅胶和氧化铝，由于吸附性好，适用于各类化合物的分离，应用最广。选择吸附剂时主要根据样品的溶解度、酸碱性及极性。氧化铝一般是微碱性吸附剂，适用于碱性物质及中性物质的分离；而硅胶是微酸性吸附剂，适用于酸性物质及中性物质的分离。以下简单介绍吸附剂的几个基本参数。
种类：常用：氧化铝（强极性）、硅胶（中强极性）
不常用：硅藻土、纤维素、糖类、活性碳
符号：H——无任何添加剂；G——加有锻石膏（Gypsum，CaSO4·1/2 H2O）粘合剂；
F——加有荧光素（Fluorescein）
CMC——加有羧甲基纤维素钠（Carboxymethyl cellulose）
例：硅胶GF254表示硅胶中既加有煅石膏粘合剂，也加有荧光素，可以在波长254nm的紫外光下激发出荧光
粒度：目：1cm2内的筛孔数，数目越大，颗粒越小。薄层所用吸附剂颗粒较细，氧化铝为200目，硅胶为100~150目。
μ：颗粒的平均直径，以微米表示。例如：40μ的颗粒与100目相当。
活性：
吸附剂按其含水量的多少各分为五个等级：I级含水量最少，活性最高；V级含水量最多，活性最低；但并不是活性越高分离效果越好，选用哪种活性级别的吸附剂，要用实验的方法来确定。
酸碱性：
市售氧化铝有酸性（用以分离酸性化合物）、中性、碱性（用以分离生物碱等碱性化合物），其蒸馏水洗出液的pH值分别为4、7.5、9—10；其中以中性氧化铝应用最广，可用来分离各种化合物，特别是那些对酸、碱敏感的化合物。
硅胶没有酸碱性之分。

（3）展开剂
在样品组分-吸附剂-展开剂三个因素中。对一确定组分，样品的结构和性质可看作是一不变因素，吸附剂和展开剂是可变因素。而吸附剂的种类有限，因此选择合适的展开剂就成为解决问题的关键。展开剂的选择有以下要求:
（a）对待测组分有很好的溶解度。
（b）能使待测组分与杂质分开，与基线分离。
（c）使展开后的组分斑点圆而集中，不应有拖尾现象。
（d）使待测组分的Rf值最好在0.4~0.5，如样品中待测组分较多，Rf值则可在0.25~0.75范圈内，组分间的Rf值最好相差0.1左右。由于薄层色谱法用途非常广泛，国内外均有现成的铺有吸附剂的薄层板出售。一般实验室中也可自己制备。
(e)不与组分发生化学反应，或在某些吸附剂存在下发生聚合。
(f)具有适中的沸点和较低的粘滞度。
展开剂的极性是指与样品组分相互作用时。展开剂分子与吸附剂分子的色散作用、偶极作用、氢键作用及介电作用的总和。展开剂要根据样品的极性及溶解度，吸附剂活性等因素进行选择，总的原则是展开剂的极性能使组分的Rf值在0.5左右。常用溶剂极性次序是：石油醚<环己烷<苯<乙醚<氯仿<乙酸丁酯<正丁醇<丙酮<乙醇<甲醇。
如一种溶剂不能充分展开，可选用二元或多元溶剂系统。

3．展开槽与展开：
薄层的展开在密闭的容器即展开槽或称为层析缸中进行。
展开：
合适的展开剂用量为浸及下端硅胶，但不浸及样点；点样端向下，每次只展开一块，放在正中，以免爬斜（进而展开倾斜）。

4．显色：
如果化合物本身有颜色，就可直接观察它的斑点。如果本身无色，可先在紫外灯光下观察有无荧光斑点（有苯环的物质都有），用铅笔在薄层板上划出斑点的位置；对于在紫外灯光下不显色的，可放在含少量碘蒸气的容器中显色来检查色点（因为许多化合物都能和碘成黄棕色斑点），显色后，立即用铅笔标出斑点的位置。常用
普适性显色剂：浓硫酸、碘蒸气、荧光素，专用显色剂：茚三酮、三氯化铁溶液等。

三、实验仪器与药品
仪器：半微量玻璃仪器一箱，小烧杯，层析缸(槽)，载玻片(100mm×25mm)干燥器，电吹风，毛细管，移液管，研钵，布氏漏斗，抽滤装置。
试剂：硅胶，1％ CMC，石油醚（60~90℃），乙醇，丙酮，乙醚，饱和NaCl溶液，无水Na2SO4

四、实验步骤

1．制板：
将硅胶加 1％ CMC，调成桨状(硅胶：CMC=1:3~4)（在平铺玻璃板上能晃动但不能流动），将其涂在载玻片上（100mm×25mm）），为使其坦平，可将载玻片用手端平晃动，至平坦为止，放在干净平坦的台面上，晾干之后放入105℃烘箱活化1小时，取出放入干燥器内待用。

2、叶绿素的提取
在研钵中放入几片(约5g)菠菜叶(新鲜的或冷冻的都可以．如果是冷冻的，解冻后包在纸中轻压吸左水分)。加人10mL2:1石油醚和乙醇混合液，适当研磨。将提取液用滴管转移至分液漏斗中，加人10 mL饱和NaCl溶液(防止生成乳浊液)除去水溶性物质，分去H2O层，再用蒸馏水洗涤两次。将有机层转入干燥的小锥形瓶中，加2g入无水Na2SO4干燥。干燥后的液体倾至另—锥形瓶中(如溶液颜色太浅，可在通风柜中适当蒸发浓缩)。

3、点样
用一根内径 1mm的毛细管，吸取适量提取液，轻轻地点在距薄板一端1.5cm处，平行点两点，两点相距1cm左右。若一次点样不够，可待样品溶剂挥发后．再在原处点第二次，但点样斑点直径不得越过2mm。

4、展开
先在层析缸中放入展开剂[石油醚（60~90℃）-丙酮—乙醚(体积比为3:1:1)]，加盖使缸内蒸气饱10min， 再将薄层板斜靠于层析缸内壁。点样端接触展开剂但样点不能浸没于展开剂中，密闭层祈缸。待展开剂上升到距薄层板另一端约1crm时，取出平放，用铅笔或小针划前沿线位置，晾干或用电吹风吹干薄层。

五、实验注意事项
1．制板时用注意使板上硅胶厚度尽量一致。
2．植物叶片不要研成糊状，否则会给分离造成困难