达鲁舍替的生物活性和实验方法

达鲁舍替是一种具有潜在抗肿瘤活性的小分子3-氨基吡唑衍生物。 达鲁舍替结合并抑制Aurora激酶，这可能导致Aurora激酶过度表达的肿瘤细胞中细胞生长停滞和凋亡。

一、达鲁舍替的生物活性详解：
1）体外活性
达鲁舍替（0.01至50μM）显着降低C13和A2780cp细胞的活力。 C13细胞的IC50为10.40和1.83μM，24小时和48小时后的A2780cp细胞的IC50为19.89和3.88μM。 达鲁舍替诱导C13和A2780cp细胞G2 / M期细胞周期停滞。 达鲁舍替处理导致在G2 / M期停滞的细胞百分比显着增加，并且C13和A2780cp细胞中多倍体积累。 达鲁舍替降低CDK1 / CDC2和细胞周期蛋白B1的表达，但促进p21 Waf1 / Cip1，p27 Kip1和p53的表达。 达鲁舍替诱导C13和A2780cp细胞自噬，参与PI3K / Akt / mTOR信号通路[1]。 PHA-739358强烈抑制所有测试的白血病细胞系的增殖，IC 50值范围为0.05μM至3.06μM。 PHA-739358在BaF3-p210细胞中诱导抗增殖作用，包括IM抗性M351T，E255K和T315I突变体。 PHA-739358（5μM）可降低BaF3-p210 wt细胞和IM抗性突变体中CrkL的磷酸化[2]。 达鲁舍替sertib导致细胞周期停滞并完全抑制GEP-NET细胞的体外增殖[3]。

2）体内活性
PHA-739358（15mg / kg，每天两次，腹膜内注射）和IM耐受性良好，并且在10天治疗期间显着抑制K562细胞的增殖并且几乎抑制肿瘤生长[2]。 在皮下小鼠异种移植模型中，与对照组或用链脲佐菌素/ 5-氟尿嘧啶治疗的小鼠相比，达鲁舍替sertib（2×15 mg / kg / d，i.p。）显着降低了体内肿瘤生长[3]。

二、达鲁舍替的实验方法：
1）动物实验
为了评估PHA-739358在体内的功效和毒性，使用CML的皮下动物模型; 将5×107个K562细胞注射到雌性SCID小鼠的侧腹中，并通过触诊每天监测肿瘤生长。 在第7天，当肿瘤达到估计重量100至150mg时，通过随机选择将动物分配至3个实验组，并接受以下治疗10天的时间：第1组，对照，载体溶液（7只小鼠）; 第2组，PHA-739358，每天两次腹腔注射，剂量为15mg / kg（7只小鼠）; 和组3，IM每天口服两次100mg / kg。 通过厚度评估肿瘤生长，并根据下式计算肿瘤重量：肿瘤重量= [长度（mm）×宽度2（mm）] / 2。 通过体重和动物活力的变化来监测毒性。

2）细胞实验
进行MTT测定以检查达鲁舍替对C13和A2780cp细胞活力的影响。 简言之，将细胞以8×10 3个细胞/孔的密度接种在96孔培养板中。 附着细胞后，用不同浓度（0.01-50μM）的达鲁舍替处理细胞。 对照细胞仅接收载体。 孵育24小时后，向每个孔中加入10μLMTT（5g / L）并再培养4小时。 然后，小心吸出培养基并加入100μLDMSO。 用Synergy H4 Hybrid酶标仪测量450nm波长的吸光度。 使用GraphPad Prism 6.0，使用相对于达鲁舍替浓度曲线的相对存活率测定IC 50值。

3）激酶实验
首先测定ATP和特异性底物的Km值，然后在优化的ATP（2Km）和底物（5Km）浓度下进行每个测定。 此设置可以直接比较达鲁舍替在应用的激酶选择性筛选组中的IC50值，以评估选择性特征。

综上所述：达鲁舍替是一种极光激酶 (aurora kinase) 抑制剂，能够抑制 Aurora A，Aurora B 和 Aurora C 的活性，IC50 值分别为 13，79 和 61 nM。它的靶点活性为Abl,25nM；Aurora A,13nM；Aurora B,79nM；Aurora C,61nM；FGFR1,47nM；RET,31nM；TrkA,31nM。

参考文献：
[1]. Zi D, et al. Danusertib Induces Apoptosis, Cell Cycle Arrest, and Autophagy but Inhibits Epithelial to Mesenchymal Transition Involving PI3K/Akt/mTOR Signaling Pathway in Human Ovarian Cancer Cells. Int J Mol Sci. 2015 Nov 13;16(11):27228-51.
[2]. Gontarewicz A, et al. Simultaneous targeting of Aurora kinases and Bcr-Abl kinase by the small molecule inhibitor PHA-739358 is effective against imatinib-resistant BCR-ABL mutations including T315I. Blood. 2008 Apr 15;111(8):4355-64.
[3]. Fraedrich K, et al. Targeting Aurora Kinases with Danusertib (PHA-739358) Inhibits Growth of Liver Metastases from Gastroenteropancreatic Neuroendocrine Tumors in an Orthotopic Xenograft Model. Clin Cancer Res. 2012 Sep 1;18(17):4621-32. Epub 2012 Jul 2.