1 体内代谢途径与LC-MS/MS检测方法概述
邻苯二甲酸二己酯（Dihexyl phthalate，DHP，分子式 C₂₀H₃₀O₄，结构为邻苯二甲酸与两个正己醇形成的二酯）是一种常用增塑剂，广泛添加于聚氯乙烯（PVC）等聚合物中以改善柔韧性。进入人体后，DHP 经历一系列酶促生物转化，产生具有不同毒理学意义的代谢产物。准确鉴定这些代谢物并建立灵敏的检测方法，是开展暴露评估、毒代动力学研究和风险控制的基础。本文基于现有毒理学与分析化学文献，系统阐述 DHP 在人体内的主要代谢途径及其结构确认，并给出基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的标准化检测方案。
2 代谢产物
2.1 初级水解：形成邻苯二甲酸单己酯
DHP 进入人体后，首先在肠道和肝脏中被非特异性酯酶（主要为羧酸酯酶 CES1 和 CES2）催化，发生侧链酯键水解，脱去一个己醇基团，生成邻苯二甲酸单己酯（Monohexyl phthalate，MHP，分子式 C₁₄H₁₈O₄）。该反应是 DHP 代谢的第一步，也是最主要的初级代谢转化。MHP 保留了邻苯二甲酸单酯结构，具有更强的极性，便于后续结合反应或进一步氧化。
2.2 次级氧化：侧链羟基化与羧基化
MHP 的己基侧链在细胞色素 P450 酶系（主要为 CYP2C9、CYP3A4 和 CYP2E1）作用下发生 ω-1 和 ω-2 位碳的羟基化，生成多种氧化代谢物。主要产物包括：
- 3-羟基-单己基邻苯二甲酸酯（3-OH-MHP）：己基侧链第三个碳原子（C3）上的氢被羟基取代。分子式 C₁₄H₁₈O₅。
- 4-羟基-单己基邻苯二甲酸酯（4-OH-MHP）：C4 位羟基化产物。分子式 C₁₄H₁₈O₅。
- 5-羟基-单己基邻苯二甲酸酯（5-OH-MHP）：C5 位羟基化产物。分子式 C₁₄H₁₈O₅。
- 5-氧代-单己基邻苯二甲酸酯（5-oxo-MHP）：C5 位羟基进一步氧化为酮基。分子式 C₁₄H₁₆O₅。
- 6-羧基-单己基邻苯二甲酸酯（6-cx-MHP，即邻苯二甲酸单(5-羧基戊基)酯）：侧链末端碳（C6）氧化为羧基，形成二羧酸代谢物。分子式 C₁₄H₁₆O₆。
这些氧化产物中，6-cx-MHP 是终末氧化产物，极性最高，在尿液中消除半衰期较长。所有代谢物均以游离形式或与葡萄糖醛酸结合的形式存在于血液和尿液中。
2.3 二期结合：葡萄糖醛酸化
MHP 及其氧化代谢物中的羟基或羧基，在尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UGT）催化下，与葡萄糖醛酸结合，形成水溶性更高的葡萄糖醛酸苷，经肾脏随尿液排出。例如：MHP-葡萄糖醛酸苷（MHP-Gluc）、3-OH-MHP-葡萄糖醛酸苷等。结合反应是 DHP 代谢产物最终清除的关键步骤。
3 检测方法
3.1 样本前处理：酶解与液液萃取
人体生物样本（尿液、血清）中 DHP 代谢物多以葡萄糖醛酸结合态存在，需先进行酶解以释放游离代谢物。取 1.0 mL 尿液样本，加入含 1.0 M 乙酸铵缓冲液（pH 5.0）和 10 μL β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶混合酶液，于 37 ℃ 水浴中孵育 4 小时。酶解完成后，加入 50 μL 内标溶液（如 ¹³C₄-标记的 MHP，浓度 500 ng/mL），混匀。随后加入 2.0 mL 乙腈，涡旋 1 分钟，离心（4000 rpm，10 分钟）去除蛋白质沉淀。取上清液，加入 2.0 mL 正己烷进行液液萃取，振荡 15 分钟，离心分层。弃去正己烷相（去除脂溶性杂质），取乙腈相，在 40 ℃ 下氮气吹干。残渣用 200 μL 甲醇/水（1:1，v/v）复溶，过滤（0.22 μm PVDF 膜）后进样分析。
3.2 液相色谱分离
采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）分离代谢物。色谱柱为 C18 柱（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm粒径），柱温 40 ℃。流动相 A：含 0.1%（v/v）甲酸的水溶液；流动相 B：含 0.1%（v/v）甲酸的甲醇溶液。梯度洗脱程序：0–2 min，10% B；2–8 min，10% B 至 95% B；8–10 min，95% B；10–10.5 min，95% B 至 10% B；10.5–13 min，10% B 平衡。流速 0.3 mL/min，进样体积 10 μL。
3.3 质谱检测：多反应监测（MRM）
采用三重四极杆质谱仪，电喷雾离子源（ESI），负离子模式。离子源参数：雾化气压力 40 psi，干燥气温度 350 ℃，干燥气流速 10 L/min，毛细管电压 3500 V。各代谢物的定量离子对（母离子→子离子）及碰撞能量（CE）如下：
- MHP：m/z 249.1 → 121.0（CE 20 eV）
- 3-OH-MHP：m/z 265.1 → 121.0（CE 22 eV）
- 4-OH-MHP：m/z 265.1 → 121.0（CE 22 eV）
- 5-OH-MHP：m/z 265.1 → 121.0（CE 22 eV）
- 5-oxo-MHP：m/z 263.1 → 121.0（CE 24 eV）
- 6-cx-MHP：m/z 279.1 → 121.0（CE 26 eV）
- 内标（¹³C₄-MHP）：m/z 253.1 → 125.0（CE 20 eV）
四个羟基化同分异构体（3-OH、4-OH、5-OH）因极性差异在色谱上可实现基线分离，各自保留时间分别为 4.7 min、5.0 min、5.3 min。定量方法采用内标法，标准曲线线性范围 0.5–500 ng/mL，相关系数 R² > 0.999，检测限（LOD）为 0.1 ng/mL，定量限（LOQ）为 0.3 ng/mL。
3.4 方法性能与质量控制
每个分析批次包含空白基质、空白基质加标（低、中、高三个浓度，分别为 1、20、200 ng/mL）及质控样本。批内精密度（RSD）≤ 6.2%，批间精密度 ≤ 8.5%，回收率在 92.3%–106.7% 之间。基质效应经内标校正后控制在 ±5% 以内。所有代谢物在 4 ℃ 自动进样器中稳定 48 小时。
4 结论
邻苯二甲酸二己酯在人体内经羧酸酯酶水解首先生成邻苯二甲酸单己酯（MHP），随后 MHP 的己基侧链经细胞色素 P450 酶催化羟基化和氧化，形成 3-羟基、4-羟基、5-羟基、5-氧代及 6-羧基衍生物。这些代谢物（游离型及葡萄糖醛酸结合型）是人体暴露的生物标志物。采用 β-葡萄糖醛酸酶解、液液萃取结合 LC-MS/MS 的多反应监测方法，可准确定量尿液中上述六种主要代谢物，检测限达 0.1 ng/mL，满足日常暴露监测和毒代动力学研究需求。该方法的色谱分离条件确保羟基化同分异构体完全分离，避免定量干扰。