甲磺酸伊马替尼的生物活性和实验方法
发布时间：2018-10-24 13:45:35 编辑作者：活性达人
图片：甲磺酸伊马替尼结构式
甲磺酸伊马替尼是具有抗肿瘤活性的特异性酪氨酸激酶受体抑制剂，用于治疗费城染色体阳性慢性髓性白血病和胃肠道间质瘤。
一、甲磺酸伊马替尼的生物活性详解：
1）体外活性
甲磺酸伊马替尼抑制c-Kit自身磷酸化，MAPK活化和Akt活化而不改变c-kit，MAPK或Akt的总蛋白水平。对这些影响产生50％抑制的浓度约为100 nM [1]。甲磺酸伊马替尼对慢性粒细胞白血病激酶Bcr-Abl非常有效（体外IC50为25 nM）。伊马替尼还有效抑制Kit（体外IC50,410 nM）和PDGFR（体外IC50,380 nM）[2]。甲磺酸伊马替尼是v-Abl，c-Kit的多靶点抑制剂，抑制Bcr / Abl，v-Abl，Tel / Abl，天然PDGFβ受体和c-Kit，但它不抑制Src家族激酶，c-Fms，Flt3，EGFR或多种其他酪氨酸激酶。伊马替尼抑制表达Bcr / Abl，Tel / Abl，Tel /PDGFβR和Tel / Arg的Ba / F3细胞的酪氨酸磷酸化和细胞生长，每种情况下IC50约为0.5μM，但对未转化的Ba / F3没有影响。细胞生长在IL-3或通过Tel / JAK2转化的Ba / F3细胞[3]。甲磺酸伊马替尼选择性地抑制Bcr / Abl，c-Kit和PDGFR激酶的活性。甲磺酸伊马替尼在慢性粒细胞白血病（CML）和费城阳性（Ph +）急性淋巴细胞白血病（ALL）中显示出明显和快速的抗白血病活性[4]。
2）体内活性
用甲磺酸伊马替尼治疗的动物在整个研究中显示平均体重减少。 在接受化疗和维生素D类似物联合治疗的小鼠中，体重减轻是显着的。 在实验的第22天，用甲磺酸伊马替尼和PRI-2191联合治疗的小鼠体重减轻最高（15％），但在那天之后，小鼠开始恢复[4]。 在大鼠缺血/再灌注损伤（IRI）模型中，甲磺酸伊马替尼通过抗渗透和抗炎作用减弱肺损伤。 在该模型中也证实了甲磺酸伊马替尼在肺中的传递和功能[5]。
二、甲磺酸伊马替尼的实验方法：
1）动物实验
小鼠[4]-使用12-16周龄，体重20-25g的NOD / SCID雌性小鼠。用A549肿瘤细胞悬浮液（每只小鼠0.2mL Hank培养基中5×10 6个细胞，第0天）将小鼠皮下（sc）接种在腹部右侧，然后随机分成接受维生素D类似物的不同组合的组和化疗。在相应的实验中应用两个实验方案中的一个：1。在接种肿瘤细胞后（当肿瘤变得可触知时）从第7天开始治疗。甲磺酸伊马替尼以75mg / kg /天的剂量腹膜内（i.p.）给药，每天给药19天（从第7-25天开始）。 PRI-2191由s.c.管理。或者以2μg/ kg /天的剂量口服强饲法，每周3次（第7,12,14,16,19,21和23天）。 2.在接种肿瘤细胞后（当肿瘤变得可触知时）从第7天开始治疗。甲磺酸伊马替尼以50mg / kg /天的剂量腹膜内（i.p.）给药，每天给药13天（从第7-19天开始）。 PRI-2191和PRI-2205是s.c.剂量为1或10μg/ kg /天，分别为每周3次（第7,10,12,14,17,19,21,24和26天）。在实验结束时，在麻醉下收集血液;然后，将小鼠处死。
大鼠[5]-在实验中使用重270至320g的雄性Lewis大鼠。在伊马替尼组（n = 7）腹膜内注射甲磺酸伊马替尼（50mg / kg），在载体组中给予0.5mL不含伊马替尼的20％DMSO（n = 7）。初步测试25mg / kg的剂量，并且其在肺功能方面产生少许改善而没有统计学意义。基于该结果和过去的报道，采用50mg / kg的剂量和腹膜内给药。将动物进行左胸廓切开术，并用小金属夹闭塞左肺门。在伊马替尼或载体给药后20分钟进行闭塞。夹紧期间，潮气量（TV）和呼吸频率（RR）分别调整为8 mL / kg和80次/ min。缺血90分钟后，取出夹子并保持再灌注120分钟。在再灌注期间，双侧肺中的血流和通气恢复。在假手术组（n = 6）中，将动物肝素化，胸腔切开并通气210分钟。
2）细胞实验
将BON-1细胞和NCI-H727细胞一式三份接种到平底96孔板中，并分别在10％胎牛血清补充的DMEM或RPMI 1640完全培养基中粘附过夜; 然后将培养基更换为含有连续稀释的伊马替尼的无血清培养基（阴性对照）或无血清培养基。 48小时后（对照培养物未达到汇合），通过溴化3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑鎓测定法测定代谢活性细胞的数量，并测定吸光度。 Packard Spectra酶标仪，540 nm。 使用下式计算生长抑制：抑制率=（1-a / b）×100％，其中a和b分别是处理组和对照组的吸光度值。
3）激酶实验
PDGF受体从BALB / c 3T3细胞提取物中免疫沉淀，其具有针对鼠PDGF受体的兔抗血清，在冰上2小时。 蛋白A-Sepharose珠用于收集抗原 - 抗体复合物。 用TNET（50mM Tris，pH 7.5,140mM NaCl，5mM EDTA，1％Triton X-100）洗涤免疫沉淀物两次，用TNE（50mM Tris，pH 7.5,140mM EDTA）洗涤一次，并用 激酶缓冲液（20mM Tris，pH 7.5,10mM MgCl 2）。 在4℃下用PDGF（50ng / mL）刺激10分钟后，向反应混合物中加入不同浓度的药物。 通过与10μCi[7-33P] -ATP和1μMATP在4℃温育10分钟来确定PDGF受体激酶活性。 通过SDS-PAGE在7.5％凝胶上分离免疫复合物。
综上所述：甲磺酸伊马替尼是 c-Kit，Bcr-Abl 和 PDGFR 酪氨酸激酶抑制剂，抑制 SLF 非依赖性的 c-Kitwt 激酶激活，IC50 为 100 nM。它的靶点活性为c-Kit,100nM；PDGFR,100nM；v-Abl,600nM。
参考文献：
[1]. Heinrich MC, et al. Inhibition of c-kit receptor tyrosine kinase activity by STI 571, a selective tyrosine kinase inhibitor. Blood. 2000 Aug 1;96(3):925-32.
[2]. Guida T, et al. Sorafenib inhibits imatinib-resistant KIT and platelet-derived growth factor receptor beta gatekeeper mutants. Clin Cancer Res. 2007 Jun 1;13(11):3363-9.
[3]. Okuda K, et al. ARG tyrosine kinase activity is inhibited by STI571.Blood. 2001 Apr 15;97(8):2440-8
[4]. Maj E, et al. Vitamin D Analogs Potentiate the Antitumor Effect of Imatinib Mesylate in a Human A549 Lung Tumor Model. Int J Mol Sci. 2015 Nov 13;16(11):27191-207.
[5]. Tanaka S, et al. Protective Effects of Imatinib on Ischemia/Reperfusion Injury in Rat Lung. Ann Thorac Surg. 2016 Jul 23. pii: S0003-4975(16)30523-9
[6]. Meirson T, et al. Targeting invadopodia-mediated breast cancer metastasis by using ABL kinase inhibitors. Oncotarget. 2018 Apr 24;9(31):22158-22183.
一、甲磺酸伊马替尼的生物活性详解：
1）体外活性
甲磺酸伊马替尼抑制c-Kit自身磷酸化，MAPK活化和Akt活化而不改变c-kit，MAPK或Akt的总蛋白水平。对这些影响产生50％抑制的浓度约为100 nM [1]。甲磺酸伊马替尼对慢性粒细胞白血病激酶Bcr-Abl非常有效（体外IC50为25 nM）。伊马替尼还有效抑制Kit（体外IC50,410 nM）和PDGFR（体外IC50,380 nM）[2]。甲磺酸伊马替尼是v-Abl，c-Kit的多靶点抑制剂，抑制Bcr / Abl，v-Abl，Tel / Abl，天然PDGFβ受体和c-Kit，但它不抑制Src家族激酶，c-Fms，Flt3，EGFR或多种其他酪氨酸激酶。伊马替尼抑制表达Bcr / Abl，Tel / Abl，Tel /PDGFβR和Tel / Arg的Ba / F3细胞的酪氨酸磷酸化和细胞生长，每种情况下IC50约为0.5μM，但对未转化的Ba / F3没有影响。细胞生长在IL-3或通过Tel / JAK2转化的Ba / F3细胞[3]。甲磺酸伊马替尼选择性地抑制Bcr / Abl，c-Kit和PDGFR激酶的活性。甲磺酸伊马替尼在慢性粒细胞白血病（CML）和费城阳性（Ph +）急性淋巴细胞白血病（ALL）中显示出明显和快速的抗白血病活性[4]。
2）体内活性
用甲磺酸伊马替尼治疗的动物在整个研究中显示平均体重减少。 在接受化疗和维生素D类似物联合治疗的小鼠中，体重减轻是显着的。 在实验的第22天，用甲磺酸伊马替尼和PRI-2191联合治疗的小鼠体重减轻最高（15％），但在那天之后，小鼠开始恢复[4]。 在大鼠缺血/再灌注损伤（IRI）模型中，甲磺酸伊马替尼通过抗渗透和抗炎作用减弱肺损伤。 在该模型中也证实了甲磺酸伊马替尼在肺中的传递和功能[5]。
二、甲磺酸伊马替尼的实验方法：
1）动物实验
小鼠[4]-使用12-16周龄，体重20-25g的NOD / SCID雌性小鼠。用A549肿瘤细胞悬浮液（每只小鼠0.2mL Hank培养基中5×10 6个细胞，第0天）将小鼠皮下（sc）接种在腹部右侧，然后随机分成接受维生素D类似物的不同组合的组和化疗。在相应的实验中应用两个实验方案中的一个：1。在接种肿瘤细胞后（当肿瘤变得可触知时）从第7天开始治疗。甲磺酸伊马替尼以75mg / kg /天的剂量腹膜内（i.p.）给药，每天给药19天（从第7-25天开始）。 PRI-2191由s.c.管理。或者以2μg/ kg /天的剂量口服强饲法，每周3次（第7,12,14,16,19,21和23天）。 2.在接种肿瘤细胞后（当肿瘤变得可触知时）从第7天开始治疗。甲磺酸伊马替尼以50mg / kg /天的剂量腹膜内（i.p.）给药，每天给药13天（从第7-19天开始）。 PRI-2191和PRI-2205是s.c.剂量为1或10μg/ kg /天，分别为每周3次（第7,10,12,14,17,19,21,24和26天）。在实验结束时，在麻醉下收集血液;然后，将小鼠处死。
大鼠[5]-在实验中使用重270至320g的雄性Lewis大鼠。在伊马替尼组（n = 7）腹膜内注射甲磺酸伊马替尼（50mg / kg），在载体组中给予0.5mL不含伊马替尼的20％DMSO（n = 7）。初步测试25mg / kg的剂量，并且其在肺功能方面产生少许改善而没有统计学意义。基于该结果和过去的报道，采用50mg / kg的剂量和腹膜内给药。将动物进行左胸廓切开术，并用小金属夹闭塞左肺门。在伊马替尼或载体给药后20分钟进行闭塞。夹紧期间，潮气量（TV）和呼吸频率（RR）分别调整为8 mL / kg和80次/ min。缺血90分钟后，取出夹子并保持再灌注120分钟。在再灌注期间，双侧肺中的血流和通气恢复。在假手术组（n = 6）中，将动物肝素化，胸腔切开并通气210分钟。
2）细胞实验
将BON-1细胞和NCI-H727细胞一式三份接种到平底96孔板中，并分别在10％胎牛血清补充的DMEM或RPMI 1640完全培养基中粘附过夜; 然后将培养基更换为含有连续稀释的伊马替尼的无血清培养基（阴性对照）或无血清培养基。 48小时后（对照培养物未达到汇合），通过溴化3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑鎓测定法测定代谢活性细胞的数量，并测定吸光度。 Packard Spectra酶标仪，540 nm。 使用下式计算生长抑制：抑制率=（1-a / b）×100％，其中a和b分别是处理组和对照组的吸光度值。
3）激酶实验
PDGF受体从BALB / c 3T3细胞提取物中免疫沉淀，其具有针对鼠PDGF受体的兔抗血清，在冰上2小时。 蛋白A-Sepharose珠用于收集抗原 - 抗体复合物。 用TNET（50mM Tris，pH 7.5,140mM NaCl，5mM EDTA，1％Triton X-100）洗涤免疫沉淀物两次，用TNE（50mM Tris，pH 7.5,140mM EDTA）洗涤一次，并用 激酶缓冲液（20mM Tris，pH 7.5,10mM MgCl 2）。 在4℃下用PDGF（50ng / mL）刺激10分钟后，向反应混合物中加入不同浓度的药物。 通过与10μCi[7-33P] -ATP和1μMATP在4℃温育10分钟来确定PDGF受体激酶活性。 通过SDS-PAGE在7.5％凝胶上分离免疫复合物。
综上所述：甲磺酸伊马替尼是 c-Kit，Bcr-Abl 和 PDGFR 酪氨酸激酶抑制剂，抑制 SLF 非依赖性的 c-Kitwt 激酶激活，IC50 为 100 nM。它的靶点活性为c-Kit,100nM；PDGFR,100nM；v-Abl,600nM。
参考文献：
[1]. Heinrich MC, et al. Inhibition of c-kit receptor tyrosine kinase activity by STI 571, a selective tyrosine kinase inhibitor. Blood. 2000 Aug 1;96(3):925-32.
[2]. Guida T, et al. Sorafenib inhibits imatinib-resistant KIT and platelet-derived growth factor receptor beta gatekeeper mutants. Clin Cancer Res. 2007 Jun 1;13(11):3363-9.
[3]. Okuda K, et al. ARG tyrosine kinase activity is inhibited by STI571.Blood. 2001 Apr 15;97(8):2440-8
[4]. Maj E, et al. Vitamin D Analogs Potentiate the Antitumor Effect of Imatinib Mesylate in a Human A549 Lung Tumor Model. Int J Mol Sci. 2015 Nov 13;16(11):27191-207.
[5]. Tanaka S, et al. Protective Effects of Imatinib on Ischemia/Reperfusion Injury in Rat Lung. Ann Thorac Surg. 2016 Jul 23. pii: S0003-4975(16)30523-9
[6]. Meirson T, et al. Targeting invadopodia-mediated breast cancer metastasis by using ABL kinase inhibitors. Oncotarget. 2018 Apr 24;9(31):22158-22183.
相关化合物：甲磺酸伊马替尼
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