乐伐替尼的作用和生物活性

乐伐替尼是一种激酶抑制剂。乐伐替尼的作用机制是作为受体酪氨酸激酶抑制剂。

一、乐伐替尼的生物活性详解：
1）体外活性
乐伐替尼抑制KIT激酶，IC50值为100nM。乐伐替尼以剂量依赖性方式抑制SCF-和VEGF诱导的管形成，IC50值分别为5.2和5.1nM。乐伐替尼以抑制KIT激酶所需的浓度抑制SCF诱导的另一种表达KIT的人SCLC，H526细胞的增殖。乐伐替尼对HUVEC中KDR和KIT磷酸化的IC50值比体外H146增殖的IC50值低约500倍[1]。

乐伐替尼抑制人乳腺癌细胞诱导的血管生成和淋巴管生成，并显着抑制MDA-MB-231的肿瘤生长。乐伐替尼和bevacizumab治疗使MVD降低几乎相同的程度[2]。乐伐替尼在大多数细胞系中抑制高浓度（平均IC50为23.6-44.17μM）的增殖，而KM12C结肠癌细胞系中的IC50为9.54μM[3]。

体外受体酪氨酸和丝/苏氨酸激酶实验中，乐伐替尼抑制Flt-1，KDR和Flt-4，IC50分别为22，4.0和5.2nM。最新研究显示，1μM和10μM乐伐替尼通过抑制FGFR和PDGFR信号通路明显抑制细胞迁移和入侵。乐伐替尼有效抑制血管生成，也明显抑制VEGF/KDR和SCF/KIT信号通路。乐伐替尼也抑制FGFR1和PDGFR酪氨酸激酶，作用于FGFR1，PDGFRα和PDGFRβ时，IC50分别为46，51和100nM。乐伐替尼分别作用于由血管内皮生长因子和血管内皮生长因子-C刺激的HUVECs，有效抑制VEGFR2和VEGFR3磷酸化，IC50分别为0.83nM和0.36nM。

2）体内活性
乐伐替尼以剂量依赖性方式抑制H146肿瘤在30和100mg/kg（BID，QDx21）下的生长，并在H146异种移植模型中导致100mg/kg的肿瘤消退。用抗CD31抗体进行的IHC分析显示，与抗VEGF抗体和伊马替尼治疗相比，100mg/kg的乐伐替尼降低了微血管密度[1]。施用乐伐替尼（100mg/kg，口服），贝伐单抗在m.f.p.显着抑制局部肿瘤生长，并且在治疗结束时，乐伐替尼也显着抑制区域淋巴结和远处肺的转移[2]。

二、乐伐替尼的活性实验方法：
1）动物实验
将雌性BALB/c裸鼠（8-12周龄，20-25g）保持在洁净室条件下。将H146肿瘤细胞（6.5×106）皮下（s.c.）植入小鼠的胁腹区域。接种后12天，将小鼠随机分为对照组（n=12）和治疗组（n=6或n=5），此时间点确定为第1天.乐伐替尼和Imatinib以及VEGF中和抗体悬于0.5分别为甲基纤维素和盐水，并且每天两次口服施用乐伐替尼和伊马替尼，并且从第1天到第21天每周两次施用抗体。在指定的天数测量肿瘤体积并计算。抗肿瘤活性显示为相对肿瘤体积（RTV=在第1天指示的天数/体积下计算的肿瘤体积）。

2）细胞实验
在含有0.5％BSA的SFM中的H146（1.2×103细胞/50μL/孔）在96孔多板中培养。在37℃过夜培养后，加入含有0.5％FBS和几种浓度SCF的SFM（150μL/孔），加入或不加入几种浓度的化合物。培养72小时后，通过WST-1测量存活细胞的比例。

3）激酶实验
使用受体的重组激酶结构域，通过HTRF（KDR，VEGFR1，FGFR1，c-Met，EGFR）和ELISA（PDGFRβ）进行酪氨酸激酶测定。在两种测定中，将4μL系列稀释的乐伐替尼在96孔圆板中与10μL酶，16μL聚（GT）溶液（250ng）和10μLATP溶液（1μMATP）混合（DMSO的最终浓度为0.1％）。在空白孔中，不添加酶。在对照孔中，不添加测试物品。通过向每个孔中加入ATP溶液来启动激酶反应。在30℃温育30分钟后，通过向每个孔中的反应混合物中加入0.5MEDTA（10μL/孔）来终止反应。将足以进行每种激酶测定的稀释缓冲液加入到反应混合物中。

在HTRF测定中，将50μL反应混合物转移至96孔1/2区域黑色EIA/RIA板，将HTRF溶液（50μL/孔）加入反应混合物中，然后通过下式确定激酶活性：用时间分辨荧光检测器测量荧光，激发波长为337nm，发射波长为620和665nm。在ELISA中，将50μL反应混合物在抗生物素蛋白包被的96孔聚苯乙烯板中在室温下孵育30分钟。用洗涤缓冲液洗涤后，加入PY20-HRP溶液（70μL/孔），将反应混合物在室温下温育30分钟。用洗涤缓冲液洗涤后，向每个孔中加入TMB试剂（100μL/孔）。几分钟（10-30分钟）后，向每个孔中加入1MH3PO4（100μL/孔）。通过用酶标仪测量450nm处的吸光度来确定激酶活性。

综上所述：乐伐替尼是一种可口服的多靶点抑制剂，能够抑制VEGFR2(KDR)/VEGFR3(Flt-4)的活性，IC50值为4nM/5.2nM。它的靶点活性为FGFR1,46nM；PDGFRβ,39nM；VEGFR1/FLT1,22nM；VEGFR2/KDR,4.0nM；VEGFR3/FLT4,5.2nM。

参考文献：
[1]. Matsui J, et al. E7080, a novel inhibitor that targets multiple kinases, has potent antitumor activities against stem cell factor producing human small cell lung cancer H146, based on angiogenesis inhibition. Int J Cancer. 2008, 122(3), 664-671.
[2]. Matsui J, et al. Multi-kinase inhibitor E7080 suppresses lymph node and lung metastases of human mammary breast tumor MDA-MB-231 via inhibition of vascular endothelial growth factor-receptor (VEGF-R) 2 and VEGF-R3 kinase. Clin Cancer Res. 2008, 14(17),545
[3]. Glen H, et al. E7080, a multi-targeted tyrosine kinase inhibitor suppresses tumor cell migration and invasion. BMC Cancer. 2011, 11, 309.