多韦替尼二乳酸的作用和生物活性
发布时间：2018-11-04 18:09:21 编辑作者：活性达人
图片：多韦替尼二乳酸结构式
多韦替尼二乳酸是一种多靶点RTK抑制剂，主要用于III类（FLT3/c-Kit），IC50为1nM/2nM，对IV类也有效（FGFR1/3）和V类（VEGFR1-4）RTK，IC50为8-13nM，对InsR，EGFR，c-Met，EphA2，Tie2，IGFR1和HER2的效力较低。那么它的生物活性是什么？如何做实验呢？下面让小编给您详细说明。
首先我们介绍多韦替尼二乳酸的生物活性：
1）体外活性
多韦替尼有效抑制FGF刺激的WT和F384L-FGFR3表达B9细胞的生长，IC50为25nM。此外，多韦替尼抑制表达各种活化的FGFR3突变体的B9细胞的增殖。有趣的是，不同FGFR3突变对多韦替尼的敏感性存在极小的观察差异，各种突变的IC50范围为70至90nM。
仅含有载体的IL-6依赖性B9细胞（B9-MINV细胞）在浓度高达1μM时对多韦替尼的抑制活性具有抗性。多韦替尼抑制KMS11（FGFR3-Y373C），OPM2（FGFR3-K650E）的细胞增殖，以及KMS18（FGFR3-G384D）细胞的IC50分别为90nM（KMS11和OPM2）和550nM。多韦替尼可抑制FGF介导的ERK1/2磷酸化，并在表达FGFR3的原代MM细胞中诱导细胞毒性。BMSCs确实具有适度的细胞毒性。
对于用500nM多韦替尼处理并在基质上培养的细胞，生长抑制率为44.6％，而在没有BMSCs的情况下，生长抑制率为71.6％。多韦替尼抑制M-NFS-60（一种M-CSF生长驱动的小鼠成髓细胞系）的增殖中位有效浓度（EC50）为220nM。[1]用多韦替尼治疗SK-HEP1细胞导致细胞数量和G2/M期阻滞的剂量依赖性减少，G0/G1期和S期减少，抑制锚定非依赖性生长和阻断bFGF诱导的细胞运动。
多韦替尼在SK-HEP1细胞中的IC50约为1.7μM。多韦替尼还显着降低SK-HEP1和21-0208细胞中FGFR-1，FGFR底物2α（FRS2-α）和ERK1/2的基础磷酸化水平，但不显着降低Akt。在21-0208HCC细胞中，多韦替尼显着抑制bFGF诱导的FGFR-1，FRS2-α，ERK1/2的磷酸化，但不抑制Akt。[2]
2）体内活性
多韦替尼在体内诱导细胞抑制和细胞毒性反应，导致表达FGFR3的肿瘤消退[1]。多韦替尼显示对肿瘤异种移植物中表达的靶受体酪氨酸激酶（RTK）的剂量和暴露依赖性抑制。多韦替尼有效抑制六种HCC细胞系的肿瘤生长。血管生成的抑制与FGFR/PDGFRβ/VEGFR2信号传导途径的失活相关。在原位模型中，多韦替尼有效抑制原发性肿瘤生长和肺转移并显着延长小鼠存活。[2]多韦替尼的给药导致显着的肿瘤生长抑制和肿瘤消退，包括大的已建立的肿瘤（500-1,000mm3）。[3]
我们已经了解了它的生物活性，接下来如何做活性实验呢？一般来说，有如下的三种方法：
1）动物实验
实验模型：携带KMS11细胞的8周龄feBNX小鼠。
2）细胞实验
通过3-（4,5-二甲基噻唑）-2,5-二苯基四唑（MTT）染料吸光度评估细胞活力。将细胞以每孔5×103（B9细胞）或2×104（MM细胞系）细胞的密度接种在96孔板中。将细胞与30ng/mLaFGF和100μg/mL肝素或1％IL-6一起孵育，其中指示并增加浓度的多韦替尼。对于每种浓度的多韦替尼，加入在培养基中稀释的10μL等分试样的药物或DMSO。
对于药物组合研究，将细胞与0.5μM地塞米松，100nM多韦替尼或两者同时孵育，如果指出的话。为了评价多韦替尼对粘附于BMSC的MM细胞生长的影响，在存在或不存在多韦替尼的情况下，在BMSC包被的96孔板上培养104个KMS11细胞。将板孵育48至96小时。为了评估巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）介导的生长，将5×103M-NFS-60细胞/孔与多韦替尼的连续稀释液与10ng/mLM-CSF一起孵育，并且没有粒细胞-巨噬细胞集落-刺激因子（GM-CSF）。72小时后，使用CellTiter-GloAssay测定细胞活力。每个实验条件一式三份进行。
3）激酶实验
体外激酶测定：用时间分辨荧光（TRF）或放射性形式测定多韦替尼对RTKs抑制的50％（IC50）抑制浓度，测量多韦替尼对磷酸盐转移至底物的抑制作用。在50mMHEPES（N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸），pH7.0,2mMMgCl2,10mMMnCl21mMNaF中测定FGFR3，FGFR1，PDGFRβ和VEGFR1-3的激酶结构域，取决于各酶的Km，1mM二硫苏糖醇（DTT），1mg/mL牛血清白蛋白（BSA），0.25μM生物素化肽底物（GGGGQDGKDYIVLPI）和1至30μM三磷酸腺苷（ATP）。ATP浓度等于或略低于Km。
对于c-KIT和FLT3反应，在0.25至1μM生物素化的肽底物（GGLFDDPSYVNVQNL）存在下，用0.2至8μMATP将pH升至7.5。将反应物在室温下温育1至4小时，并在含有终止反应缓冲液（25mMEDTA[乙二胺四乙酸]，50mMHEPES，pH7.5）的链霉抗生物素蛋白包被的微量滴定板上捕获磷酸化肽。使用铕标记的抗磷酸酪氨酸抗体PT66，用DELFIATRF系统测量磷酸化肽。使用XL-Fit数据分析软件4.1版（IDBS）使用非线性回归计算多韦替尼对IC50的浓度。在接近ATP的Km的ATP浓度下测定集落刺激因子-1受体（CSF-1R），PDGFRα，胰岛素受体（InsR）和胰岛素样生长因子受体1（IGFR1）激酶活性的抑制。
今天介绍了多韦替尼二乳酸的作用，并且详细地说明了它的生物活性和实验方法。多韦替尼二乳酸的靶点活性为c-Kit,2nM；FGFR1,8nM；FGFR3,9nM；FLT3,1nM；VEGFR3/FLT4,8nM。
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参考文献：
1. Trudel S, et al. Blood. 2005, 105(7), 2941-2948.
2. Huynh H, et al. J Hepatol. 2012, 56(3), 595-601.
3. Lee SH, et al. Clin Cancer Res. 2005, 11(10), 3633-3641.
4. Azab AK, et al. Clin Cancer Res, 2011, 17(13), 4389-4399.
5. Trudel S, et al. Blood, 2005, 105(7), 2941-2948.
首先我们介绍多韦替尼二乳酸的生物活性：
1）体外活性
多韦替尼有效抑制FGF刺激的WT和F384L-FGFR3表达B9细胞的生长，IC50为25nM。此外，多韦替尼抑制表达各种活化的FGFR3突变体的B9细胞的增殖。有趣的是，不同FGFR3突变对多韦替尼的敏感性存在极小的观察差异，各种突变的IC50范围为70至90nM。
仅含有载体的IL-6依赖性B9细胞（B9-MINV细胞）在浓度高达1μM时对多韦替尼的抑制活性具有抗性。多韦替尼抑制KMS11（FGFR3-Y373C），OPM2（FGFR3-K650E）的细胞增殖，以及KMS18（FGFR3-G384D）细胞的IC50分别为90nM（KMS11和OPM2）和550nM。多韦替尼可抑制FGF介导的ERK1/2磷酸化，并在表达FGFR3的原代MM细胞中诱导细胞毒性。BMSCs确实具有适度的细胞毒性。
对于用500nM多韦替尼处理并在基质上培养的细胞，生长抑制率为44.6％，而在没有BMSCs的情况下，生长抑制率为71.6％。多韦替尼抑制M-NFS-60（一种M-CSF生长驱动的小鼠成髓细胞系）的增殖中位有效浓度（EC50）为220nM。[1]用多韦替尼治疗SK-HEP1细胞导致细胞数量和G2/M期阻滞的剂量依赖性减少，G0/G1期和S期减少，抑制锚定非依赖性生长和阻断bFGF诱导的细胞运动。
多韦替尼在SK-HEP1细胞中的IC50约为1.7μM。多韦替尼还显着降低SK-HEP1和21-0208细胞中FGFR-1，FGFR底物2α（FRS2-α）和ERK1/2的基础磷酸化水平，但不显着降低Akt。在21-0208HCC细胞中，多韦替尼显着抑制bFGF诱导的FGFR-1，FRS2-α，ERK1/2的磷酸化，但不抑制Akt。[2]
2）体内活性
多韦替尼在体内诱导细胞抑制和细胞毒性反应，导致表达FGFR3的肿瘤消退[1]。多韦替尼显示对肿瘤异种移植物中表达的靶受体酪氨酸激酶（RTK）的剂量和暴露依赖性抑制。多韦替尼有效抑制六种HCC细胞系的肿瘤生长。血管生成的抑制与FGFR/PDGFRβ/VEGFR2信号传导途径的失活相关。在原位模型中，多韦替尼有效抑制原发性肿瘤生长和肺转移并显着延长小鼠存活。[2]多韦替尼的给药导致显着的肿瘤生长抑制和肿瘤消退，包括大的已建立的肿瘤（500-1,000mm3）。[3]
我们已经了解了它的生物活性，接下来如何做活性实验呢？一般来说，有如下的三种方法：
1）动物实验
实验模型：携带KMS11细胞的8周龄feBNX小鼠。
2）细胞实验
通过3-（4,5-二甲基噻唑）-2,5-二苯基四唑（MTT）染料吸光度评估细胞活力。将细胞以每孔5×103（B9细胞）或2×104（MM细胞系）细胞的密度接种在96孔板中。将细胞与30ng/mLaFGF和100μg/mL肝素或1％IL-6一起孵育，其中指示并增加浓度的多韦替尼。对于每种浓度的多韦替尼，加入在培养基中稀释的10μL等分试样的药物或DMSO。
对于药物组合研究，将细胞与0.5μM地塞米松，100nM多韦替尼或两者同时孵育，如果指出的话。为了评价多韦替尼对粘附于BMSC的MM细胞生长的影响，在存在或不存在多韦替尼的情况下，在BMSC包被的96孔板上培养104个KMS11细胞。将板孵育48至96小时。为了评估巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）介导的生长，将5×103M-NFS-60细胞/孔与多韦替尼的连续稀释液与10ng/mLM-CSF一起孵育，并且没有粒细胞-巨噬细胞集落-刺激因子（GM-CSF）。72小时后，使用CellTiter-GloAssay测定细胞活力。每个实验条件一式三份进行。
3）激酶实验
体外激酶测定：用时间分辨荧光（TRF）或放射性形式测定多韦替尼对RTKs抑制的50％（IC50）抑制浓度，测量多韦替尼对磷酸盐转移至底物的抑制作用。在50mMHEPES（N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸），pH7.0,2mMMgCl2,10mMMnCl21mMNaF中测定FGFR3，FGFR1，PDGFRβ和VEGFR1-3的激酶结构域，取决于各酶的Km，1mM二硫苏糖醇（DTT），1mg/mL牛血清白蛋白（BSA），0.25μM生物素化肽底物（GGGGQDGKDYIVLPI）和1至30μM三磷酸腺苷（ATP）。ATP浓度等于或略低于Km。
对于c-KIT和FLT3反应，在0.25至1μM生物素化的肽底物（GGLFDDPSYVNVQNL）存在下，用0.2至8μMATP将pH升至7.5。将反应物在室温下温育1至4小时，并在含有终止反应缓冲液（25mMEDTA[乙二胺四乙酸]，50mMHEPES，pH7.5）的链霉抗生物素蛋白包被的微量滴定板上捕获磷酸化肽。使用铕标记的抗磷酸酪氨酸抗体PT66，用DELFIATRF系统测量磷酸化肽。使用XL-Fit数据分析软件4.1版（IDBS）使用非线性回归计算多韦替尼对IC50的浓度。在接近ATP的Km的ATP浓度下测定集落刺激因子-1受体（CSF-1R），PDGFRα，胰岛素受体（InsR）和胰岛素样生长因子受体1（IGFR1）激酶活性的抑制。
今天介绍了多韦替尼二乳酸的作用，并且详细地说明了它的生物活性和实验方法。多韦替尼二乳酸的靶点活性为c-Kit,2nM；FGFR1,8nM；FGFR3,9nM；FLT3,1nM；VEGFR3/FLT4,8nM。
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参考文献：
1. Trudel S, et al. Blood. 2005, 105(7), 2941-2948.
2. Huynh H, et al. J Hepatol. 2012, 56(3), 595-601.
3. Lee SH, et al. Clin Cancer Res. 2005, 11(10), 3633-3641.
4. Azab AK, et al. Clin Cancer Res, 2011, 17(13), 4389-4399.
5. Trudel S, et al. Blood, 2005, 105(7), 2941-2948.
相关化合物：多韦替尼二乳酸
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