| 描述 |
TG003是高效的Clk1/Sty抑制剂,抑制Clk1 和Clk4的IC50值分别为20和15 nM。
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| 相关类别 |
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| 靶点 |
IC50: 20 nM (Clk1), 200 nM (Clk2), >10 μM (Clk3), 15 nM (Clk4)[1]
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| 体外研究 |
TG003对Clk1/Sty和Clk4(IC50,15-20nM)显示最有效的作用,对Clk2(200nM)显示较小的作用。 TG003通过抑制Clk介导的磷酸化来抑制体外β-珠蛋白前mRNA的SF2/ASF依赖性剪接。它抑制哺乳动物细胞中富含丝氨酸/精氨酸的蛋白质磷酸化,核斑点的解离和Clk1/Sty依赖性的可变剪接[1]。小药TG003通过调节TP53内含子9选择性剪接来增加p53β和p53γ蛋白异构体的内源性表达[2]。
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| 体内研究 |
鞘内注射TG003(1-100 pM)或IC261(0.1-1 nM)剂量依赖性地降低由角叉菜胶或CFA诱导的机械性异常性疼痛和热痛觉过敏[3]。
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| 激酶实验 |
在含有200mM Tris-HCl（pH7.5），12.5mM MgCl2,8mM二硫苏糖醇，4mM EGTA，1-20μMATP，1μCi[γ-32P]的反应混合物中测定Clks和SRPK的激酶活性。 ATP，1μgSF2/ ASF RS结构域的合成肽和0.1-1μg纯化的激酶，终体积为40μL。无论抑制剂浓度如何，将Me 2 SO的最终浓度调节至1％。将反应混合物分别在30或25℃下孵育10分钟，用于哺乳动物或非洲爪蟾重组蛋白，并将半部分点在P81磷酸纤维素膜上。激酶测定条件，包括孵育期和激酶和底物的浓度，被优化以在孵育期间保持线性。用至少15分钟的5％磷酸溶液或5％三氯乙酸溶液洗涤膜。使用液体闪烁计数器[1]测量放射性。
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| 细胞实验 |
将重悬于2 mL培养基中的2×105 HeLa细胞或1.5×105 COS-7细胞接种于6孔培养皿中，并将2μL10mMTG003溶于Me 2 SO（终浓度为10 mM）或2μL将Me2SO加入到一些孔中。用胰蛋白酶消化细胞，每24小时计数密度3天。然后将细胞用1mL冰冷的70％乙醇固定，用PBS洗涤，在1mL含有1μg/ mL无DNA酶RNA酶A和50μg/ mL碘化丙啶的PBS中于37℃温育20分钟，并进行细胞周期分析[1]。
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| 参考文献 |
[1]. Muraki M, et al. Manipulation of alternative splicing by a newly developed inhibitor of Clks. J Biol Chem. 2004 Jun 4;279(23):24246-54. [2]. Marcel V, et al. Modulation of p53β and p53γ expression by regulating the alternative splicing of TP53 gene modifies cellular response. Cell Death Differ. 2014 Sep;21(9):1377-87. [3]. Kurihara T, et al. Alleviation of behavioral hypersensitivity in mouse models of inflammatory pain with two structurally different casein kinase 1 (CK1) inhibitors. Mol Pain. 2014 Mar 10;10:17.
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