| 描述 |
PRN694 是一种高度选择且有效的 T 细胞激酶 (ITK) 和静息淋巴细胞激酶 (RLK) 的共价抑制剂,其 IC50 值分别为 0.3 和 1.4 nM。
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| 相关类别 |
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| 靶点 |
IC50: 0.3 nM (ITK), 1.4 nM (RLK)
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| 体外研究 |
PRN694对ITK和RLK具有高效力,IC50值分别为0.3和1.4 nM。使用PRN694预处理,在Jurkat T细胞和新鲜分离的原代CD4或CD8 T细胞中均抑制CD3介导的CD69诱导。 PRN694浓度范围为0.1至1.0μM,可实现CD69诱导的最大抑制。 TCR活化途径的免疫印迹分析揭示了PRN694阻断NFAT1,JunB,pIκBα和pERK的活化或核转位。结果显示在高于1nM的所有浓度下用PRN694抑制Ca2 +信号传导。数据显示PRN694在超过0.37μM的浓度下显着减弱NK细胞FcR诱导的杀伤。第6天流式细胞术分析显示PRN694显着抑制抗CD3/CD28诱导的CD4和CD8 T细胞增殖(p <0.01)[1]。
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| 体内研究 |
在1小时,6小时和14小时,PRK694的ITK占用率分别为98％,95％和54％。在1小时,6小时和14小时,血浆中PRN694的浓度分别为2.8,0.66和0.027μM。在14小时,PRN694的血浆水平比全血中的IC50低10倍以上。相对于载体,RN694处理也导致显着更低的重量(p <0.05)[1]。结肠炎研究表明,与对照组相比,PRN694处理小鼠结肠上皮细胞中存在的CD4 + T细胞数量减少[2]。
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| 激酶实验 |
将在50mM Hepes，pH 7.5,10mM MgCl 2,0.01％Triton X-100和1mM EGTA中的终浓度为0.5μM的重组ITK与1.5μMPRN694组合90分钟以促进结合。然后将混合物稀释50倍以引发配体与酶的解离，并将10μL转移至Greiner 384-孔黑色板。向每个孔中加入铕偶联的抗His6抗体并孵育5分钟，然后加入ITK结合荧光示踪剂。示踪剂作为配体解离的功能与ITK结合，并且通过铕偶联的抗体和平板读数器上的示踪剂之间的时间分辨FRET检测结合。获得的时间点分别为0.25,1,3,6和24小时[1]。
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| 细胞实验 |
使用含有10％胎牛血清的RPMI 1640在37℃和5％CO 2下体外培养细胞。用PRN694或其他抑制剂预处理细胞30分钟，然后洗涤两次。然后用1μg/ mL可溶性抗CD3刺激T细胞6小时，用于CD69活化，通过流式细胞术检测，或用板结合抗CD3（10μg/ mL接种浓度）和可溶性抗体检测45分钟。 -CD28（1μg/ mL）用于通过免疫印迹分析下游信号。用板结合的抗CD52刺激NK细胞6小时，CD107a / b激活，通过流式细胞术检测，或通过免疫印迹分析下游信号分析45分钟[1]。
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| 动物实验 |
将小鼠按重量随机分组并用等份的150μL5％恶唑酮在3份乙醇和1份丙酮中对其剃毛的腹部进行致敏。致敏后7天，在右耳的前部和后部用10μL的3％恶唑酮攻击小鼠。左耳用乙醇/丙酮混合物处理。在攻击前1小时，动物接受载体对照（5％乙醇，95％Captex 355 NP / EF，腹膜内注射5mL / kg），20mg / kg PRN694,5％乙醇，95％Captex（腹膜内）注射5 mL / kg）或0.5 mg / kg地塞米松（5 mL / kg腹腔注射）。对照组动物不接受恶唑酮或药物治疗。在恶唑酮攻击后24小时，处死小鼠，从每只耳朵中冲出7mm圆盘并称重以测量水肿[1]。
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| 参考文献 |
[1]. Zhong Y, et al. Targeting interleukin-2-inducible T-cell kinase (ITK) and resting lymphocyte kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694. J Biol Chem. 2015 Mar 6;290(10):5960-78. [2]. Cho HS, et al. A Small Molecule Inhibitor of ITK and RLK Impairs Th1 Differentiation and Prevents Colitis Disease Progression. J Immunol. 2015 Nov 15;195(10):4822-31.
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