CypK

CypK(N-环丙烯-L-赖氨酸)是赖氨酸的一种环丙烯衍生物,通过遗传密码扩展有效地并入抗体中。CypK是用于创建稳定的治疗性蛋白质结合物的最小生物正交手柄[1][2]。

研究领域 >> 癌症

信号通路 >> 其他 >> 其他

指南(以下是我们推荐的方案。该方案仅提供指南,应根据您的具体需要进行修改)。CypK分析[1](表达抗体)：1.将一小瓶HEK悬浮细胞放在250 mL烧瓶中解冻,烧瓶中含有50 mL表达培养基,补充100单位/mL青霉素、100µg/mL链霉素和250 ng/mL两性霉素B。将细胞置于37℃、8%CO2的增湿培养箱中,并配备125 rpm的振动筛。转染前,将细胞分裂为0.3-0.5 x 106细胞/mL(每2-3天)至少2次。2.当密度达到2.5 x 106个细胞/mL时(分裂后2-3天),制备100 mM CypK的新溶液。为此,称量64 mg CypK,添加2.5 mL 0.1氢氧化钠,旋涡,旋转,以回收所有未溶解颗粒和超声波。3.将2.5 mL CypK(0.1 M NaOH中100 mM)添加到42.5 mL添加抗生素的表达培养基中。充分混合,添加250µL 0.1 M HCl,并使用0.22µM过滤器进行消毒。4.用还原血清培养基将50µg HC和LC pKym1质粒稀释至2.5 mL。在单独的试管中,用还原血清培养基将135µL转染试剂稀释至2.5 mL。5.制备溶液5分钟后,混合质粒和转染试剂溶液,并培养20分钟,以允许DNA和转染剂之间形成复合物。6.同时,将1.25亿细胞在目标密度下以500 x g离心5分钟,用含有CypK的表达介质重新悬浮,并添加DNA转染试剂混合物。7.培养细胞20小时后,添加试剂盒中包含的250µL转染试剂增强子。8.添加CypK后6-7天从上清液中获取抗体(表达期间不需要改变培养基)。

[1]. Oller-Salvia B. Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction. J Vis Exp. 2018 Sep 14;(139):58066.

[2]. Oller-Salvia B, et, al. Rapid and Efficient Generation of Stable Antibody-Drug Conjugates via an Encoded Cyclopropene and an Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reaction. Angew Chem Int Ed Engl. 2018 Mar 5;57(11):2831-2834.