阿西替尼的作用和生物活性

发布时间:2018-11-07 14:45:46 编辑作者:活性达人

阿西替尼图片

图片:阿西替尼结构式

阿西替尼是一种口服生物可利用的酪氨酸激酶抑制剂,抑制促血管生成细胞因子血管内皮生长因子(VEGF)和血小板衍生生长因子受体(PDGF),从而发挥抗血管生成作用。那么它的生物活性是什么?如何做实验呢?下面让小编给您详细说明。

首先我们介绍阿西替尼的生物活性:

1)体外活性
阿西替尼可使VEGFR自磷酸化作用和VEGF调节的微管形成、内皮细胞活力及下游信号被阻断。它是VEGFR1至3的有效选择性抑制剂。在转染或内源性RTK表达细胞中,阿西替尼有效阻断生长因子刺激的VEGFR-2和VEGFR-3磷酸化,平均IC50值为0.2和分别为0.1至0.3nM。针对VEGFR-1的细胞活性为1.2nM(在2.3%牛血清白蛋白存在下测量),相当于基于阿西替尼的蛋白质结合的~0.1nM的绝对IC50。

阿西替尼对多种细胞系增殖均有抑制,如IGR-N91(IC50:>1000nM),IGR-NB8(IC50:849nM),SH-SY5Y(IC50:274nM),无VEGF刺激的HUVEC(IC50:573nM)。作为受体激酶抑制剂,阿西替尼对VEGFR-1(IC50:0.1nM),VEGFR-2(IC50:0.2nM),VEGFR-3(IC50:0.1-0.3nM),PDGFR-β(IC50:1.6nM)和c-KIT(IC50:1.7nM)均有抑制作用。

在Flk-1转染的NIH-3T3细胞中针对鼠VEGFR-2(Flk-1)的效力是0.18nM,类似于其人同源物的效力。阿西替尼对密切相关的III型和V型RTK显示高出约8至25倍的IC50,包括PDGFR-β(1.6nM),KIT(1.7nM)和PDGFR-α(5nM);纳摩尔浓度的阿西替尼阻断PDGFBB介导的人脑胶质瘤U87MG细胞(PDGFR-β阳性)迁移但不增殖[2]。

2)体内活性
与对照肿瘤相比,单次口服剂量的阿西替尼(100mg/kg)显着抑制鼠VEGFR-2磷酸化长达7小时。阿西替尼迅速抑制VEGF诱导的小鼠皮肤血管通透性;抑制作用呈剂量依赖性,与小鼠的药物浓度直接相关。药代动力学/药效学分析表明未结合的EC50为0.46nM。在没有外源性VEGF-A刺激的MV522荷瘤小鼠的皮肤中也显示出类似的抑制作用。

阿西替尼抑制小鼠中人异种移植肿瘤的生长。无论初始肿瘤大小,模型类型或植入部位如何,阿西替尼都会产生剂量依赖性生长延迟[2]。活体研究显示,与对照组相比,阿西替尼(30mg/kg,p.o.)组使肿瘤生长推迟11.4天;且用于IGR-N91侧腹移植瘤时,与对照组(密度为49)相比,阿西替尼组(密度为21)使血管密度降低。

阿西替尼对常位移植模型有抑制作用,如HCT-116(结肠直肠癌)、M24met(黑色素瘤)和SN12C(肾细胞癌)。在非小细胞肺癌,甲状腺癌,肾细胞癌,黑色素瘤等多种肿瘤中,阿西替尼显示出单一药效活性。

我们已经了解了它的生物活性,接下来如何做活性实验呢?一般来说,有如下的三种方法:

1)动物实验
小鼠和大鼠[2]-将具有M24met异种移植肿瘤(400-600mm3)的小鼠与单剂量的阿西替尼或对照(0.5%羧甲基纤维素/H2O)一起施用。收集血液和肿瘤组织样品用于药代动力学和VEGFR-2测量。使用Bradford比色测定法测定肿瘤组织中的总蛋白质浓度。给予6日龄Sprague-Dawley大鼠两次腹膜内注射。注射阿西替尼(30mg/kg)。处死动物,收集视网膜并裂解,并进行免疫沉淀/免疫印迹实验。ECL-Plus用于检测,使用AlphaImager8800进行光密度分析。

2)细胞实验
在1%FBS(HUVEC)或0.1%FBS(肿瘤细胞)存在下,使内皮细胞或肿瘤细胞饥饿18小时。加入阿西替尼并将细胞在1mMNa3VO4存在下于37℃温育45分钟。向细胞中加入适当的生长因子,5分钟后,用冷PBS漂洗细胞,并在裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂混合物中裂解。将裂解物与免疫沉淀抗体一起在4℃下孵育过夜蛋白质。将抗体复合物与蛋白A珠缀合,并通过SDS-PAGE分离上清液[2]。

3)激酶实验
细胞受体激酶磷酸化测定:产生过表达全长VEGFR2,PDGFRβ,Kit和NIH-3T3的猪主动脉内皮细胞(PAE)细胞,其过表达鼠VEGFR2(Flk-1)或PDGFRα。96孔板涂有100μL/孔的2.5μg/mL抗VEGFR2抗体,0.75μg/mL抗PDGFRβ抗体,0.25μg/mL抗PDGFRα抗体,0.5μg/mL抗KIT抗体,或1.20μg/mL抗Flk-1抗体制备ELISA捕获板。然后通过ELISA测量RTK的磷酸化。

今天介绍了阿西替尼的作用,并且详细地说明了它的生物活性和实验方法。综上所述,阿西替尼是一种VEGFR抑制剂,高浓度时也抑制PDGFR,作用于VEGFR1,VEGFR2,VEGFR3和PDGFRβ,IC50分别为0.1nM,0.2nM,0.1-0.3nM和1.6nM。阿西替尼的靶点活性为PDGFRβ,1.6nM;VEGFR1/FLT1,0.1nM;VEGFR2/Flk1,0.18nM;VEGFR2/KDR,0.2nM;VEGFR3,0.1nM-0.3nM。

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参考文献:
[1]. Fenton BM, et al. The addition of AG-013736 to rractionated radiation improves tumor response without functionally normalizing the tumor vasculature. Cancer Res. 2007 Oct 15;67(20):9921-8.
[2]. Hu-Lowe DD, et al. Nonclinical antiangiogenesis and antitumor activities of axitinib (AG-013736), an oral, potent, and selective inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinases 1, 2, 3. Clin Cancer Res. 2008 Nov 15;14(22):7272-83
[3]. Allen E, et al. Metabolic Symbiosis Enables Adaptive Resistance to Anti-angiogenic Therapy that Is Dependent on mTOR Signaling. Cell Rep. 2016 May 10;15(6):1144-60.

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