逆转素的作用 - 生物活性 - 靶点活性

逆转素，英文名Reversine，CAS号是656820-32-5，它是一种小型合成嘌呤类似物（2,6-二取代嘌呤），是Aurora A / B / C的有效抑制剂（IC50 = 150-500nM）。那么它的生物活性是什么？如何做实验呢？下面让小编给您详细说明。

首先我们介绍逆转素的生物活性：

1）体外活性
逆转素是一种新型Aurora激酶抑制剂，可抑制人急性髓系白血病细胞的集落形成。它是Aurora A和B的有效抑制剂，也是Aurora C激酶的抑制剂。极光A和B活性被80％抑制，极光激酶C被抑制55％，已经浓度为0.5μM，而对其他激酶没有观察到抑制或仅有适度的抑制。在第二轮实验中，逆转素的IC50在Aurora激酶A上测定为400nM，而Aurora激酶B和C IC50分别为500和400nM。在MEK1上测定的IC50>1.5μM，肌肉肌球蛋白（非肌肉肌球蛋白II的类似物）的IC50为350nM [1]。

2）体内活性
逆转素和阿司匹林的组合可以更有效地诱导细胞周期停滞和细胞凋亡。为了评估该组合的抗肿瘤效果，通过皮下建立异种移植裸鼠模型。接种宫颈癌细胞的小鼠在肿瘤接种后约16天损失了其初始体重的约10％。然而，肿瘤生长（肿瘤重量）减少，小鼠在联合组中存活时间更长[2]。

我们已经了解了逆转素的生物活性，接下来如何做活性实验呢？一般来说，有如下的三种方法：

1）细胞实验
将HCT116和HL60细胞与5μmol/ L逆转素或0.01％DMSO一起温育。收获细胞并在70％乙醇中固定过夜。用PBS双洗后，用细胞周期染色试剂PBS，0.1％Triton X-100,200μg/ mL无DNA酶RNase和25μg/ mL碘化丙啶标记细胞，并在室温下在黑暗中孵育30分钟。使用FACSCalibur分析DNA含量。使用ATPlite 1step评估不同肿瘤细胞系的细胞活力。

简言之，在新月体积的逆转素存在下，将每孔2×10 4个细胞接种在96孔板中。72小时后，回收平板并向每个孔中加入100μLATPlite溶液。将板在700rpm下振荡2分钟并使用EnVision Multilabel读板仪测量发光。每个样品一式三份进行分析[1]。

2）动物实验
小鼠[2]-使用雌性无胸腺6-8周龄BALB / c裸鼠。皮下注射U14细胞悬浮液（100μLRPMI-1640培养基中的5×10 6个细胞）。发展宫颈肿瘤的目的是产生用于药物治疗的组织学完整肿瘤。当肿瘤直径达到约1 cm时，每3天通过腹腔注射给予逆转素，阿司匹林或其组合，将这些小鼠中的25只随机分配到以下五组中的一组：（a）用小鼠治疗的小鼠 RPMI-1640培养基，（b）用DMSO处理的小鼠，（c）用逆转素（10mg / kg）处理的小鼠，（d）用阿司匹林（1μg/ kg）处理的小鼠和（e）用逆转素处理的小鼠和 阿司匹林组合。每周三次测量接种部位的体重和肿瘤大小。从两个直径每3天测量肿瘤大小，使用公式L×S2 / 2（L作为最长直径，S作为最短直径）估计肿瘤体积。

3）激酶实验
放射性配体结合试验：A3 AR竞争性结合试验中的每个试管含有100μL膜悬浮液（20μg蛋白质），50μL[125 I] 4-氨基-3-碘苄基）腺苷-5'-N-甲基尿嘧啶（0.5） 在含有10mM MgCl 2和1mM EDTA的Tris-HCl缓冲液（50mM，pH 7.4）中加入50μL浓度的测试配体。使用缓冲液中的10mM 5'-N-乙基甲酰胺基腺苷测定非特异性结合。将混合物在25℃下孵育60分钟。通过使用MT-24细胞收集器在减压下通过Whatman GF / B过滤器过滤终止结合反应。将滤器用9mL冰冷的缓冲液洗涤三次。使用Beckmanγ计数器测定放射性，并计算抑制百分比。

今天介绍了逆转素的作用，并且详细地说明了它的生物活性和实验方法。综上所述，逆转素Reversine是一种ATP-竞争性的Aurora kinase抑制剂，作用于 Aurora A，Aurora B 和 Aurora C，IC50 分别为 400，500 和 400 nM。它的靶点活性是A3,0.66μM(Ki)；A3,0.66μM(Ki)；Aurora A,12nM；Aurora B,13nM；Aurora C,20nM。

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参考文献：
[1]. D'Alise AM, et al. Reversine, a novel Aurora kinases inhibitor, inhibits colony formation of human acute myeloid leukemia cells. Mol Cancer Ther. 2008 May;7(5):1140-9.
[2]. Qin HX, et al. Synergistic antitumor activity of reversine combined with aspirin in cervical carcinoma in vitro and in vivo. Cytotechnology. 2013 Aug;65(4):643-53.