2-(3,4-二羟基苯亚甲基)-6-羟基-3(2H)-苯并呋喃酮，CAS 120-05-8，分子式为C₁₅H₁₀O₅，相对分子质量为270.24，属于3(2H)-苯并呋喃酮骨架的多羟基衍生物。结构中存在3',4'-邻二酚羟基和6位酚羟基，使该化合物具有明显酚酸性和金属配位倾向。因分子中不含碱性氮原子，正离子电喷雾难以通过质子化获得足够响应；酚羟基在负离子电喷雾中可稳定生成M−H⁻，因此LC-MS测定应以负离子模式进行。
色谱柱的选择逻辑
色谱柱宜采用耐低pH、低金属活性的十八烷基键合硅胶固定相。C18固定相对酚类化合物具有稳定疏水保留力，但普通未封端C18表面存在大量硅醇基。硅醇基在中性和碱性条件下带负电荷，会与邻二酚羟基产生次级吸附，导致峰拖尾、保留漂移和回收率下降。目标物本身含邻二酚结构，易与硅胶基质中微量金属离子发生螯合作用，因此应选择双封端或杂化颗粒型高纯硅胶C18色谱柱。
典型可用的色谱柱包括：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）和Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）。BEH C18具有低硅醇活性和宽pH耐受范围；HSS T3在高水相初始条件下对极性杂质有较好保留；Eclipse Plus C18经过双封端处理，可明显改善酚类峰形。色谱柱内径采用2.1 mm，既可满足电喷雾离子源的低流速要求，也能使柱效和灵敏度达到质谱检测的最小需求。
流动相组成与pH控制
流动相推荐采用挥发性酸性体系。首选A相为含有0.1%甲酸和5 mmol/L甲酸铵的水溶液，并以甲酸调节至pH 3.0；B相为含0.1%甲酸的乙腈溶液。甲酸提供酸性环境，使酚羟基在色谱过程中保持非离子化形态，抑制其与固定相表面极性位点发生二次作用。甲酸铵同时提供稳定缓冲容量，保证连续进样时保留时间不漂移。
酸性条件还避免目标物在碱性流动相中发生氧化。邻二酚结构在不含酸的乙腈-水体系或接近中性的醋酸铵体系中不稳定，氧化后生成醌型产物，造成色谱响应下降和质谱峰分裂。pH 3.0的流动相能够同时保持样品稳定性和可重复保留行为。磷酸盐、硼酸盐和柠檬酸盐不能作为LC-MS流动相添加剂，非挥发性盐会沉积在电喷雾接口处并显著抑制负离子信号。
乙腈作为有机相优于甲醇。乙腈的洗脱强度高，流动相粘度低，有利于液滴雾化与去溶剂化，能降低离子源背景噪声。若实际样品基质需要不同选择性，可采用甲醇替代乙腈，但B相应同时含0.1%甲酸，并延长梯度末段高比例有机相冲洗时间。
梯度洗脱与质谱运行参数
在该化合物色谱分离中，应采用初始比例较低、中等斜率平缓的线性梯度。设置柱温为40 ℃，流速为0.30 mL/min，进样体积为2 μL。梯度程序设定为：0.0～1.0 min保持15% B；1.0～5.0 min由15% B线性升至50% B；5.0～6.0 min由50% B升至90% B；6.0～7.0 min维持90% B清洗色谱柱；7.0～7.5 min回到15% B；7.5～9.5 min平衡至初始状态。该程序能保证目标物在洗脱窗口中与样品基质中的多酚类干扰物分离，并使强保留组分在90%乙腈条件充分洗脱，避免残留在柱内影响后续进样。
质谱检测采用电喷雾负离子源。目标物形成的主要离子为M−H⁻，一级质谱选择m/z 269.1作为准分子离子峰。该方法与上述酸性反相体系兼容，流动相中甲酸的挥发性和甲酸铵的低浓度不会造成明显的离子抑制。若采用串联质谱，母离子应设为m/z 269.1，再根据实际样品中干扰物分布选择信噪比最高的子离子进行多反应监测。
应用要点
样品配制溶剂应尽量接近初始流动相组成。若样品直接溶于高比例乙腈或甲醇，进样后会导致目标物在柱头过早扩散，产生前伸峰或分叉峰。样品溶剂中的乙腈比例应不高于初始梯度比例。方法建立时应考察系统适用性：目标峰理论塔板数不应低于8000，拖尾因子应处于0.9～1.2范围，连续六针保留时间相对标准偏差应小于0.5%。该条件满足植物提取物、生物样品和体外代谢样品中该化合物的液相色谱-质谱联用定量与确证需求。