分子特性决定分离策略
2-氨基-5-甲基苯甲酸，CAS 2941-78-8，分子式 C₈H₉NO₂，分子量 151.16。该分子以苯甲酸为母核，2 位为氨基，5 位为甲基。羧基提供酸性，氨基提供碱性，苯环提供紫外生色团。游离态极性高、挥发性低，反相液相色谱需要酸性流动相抑制羧基解离并减弱氨基与硅醇基的次级作用。紫外检测选择 230 nm 和 254 nm。质谱正离子模式得到M+H⁺ m/z 152.1，负离子模式得到M−H⁻ m/z 150.1。纯度评价覆盖主含量、有关物质、残留溶剂、元素杂质、水分和灰分。
高效液相色谱法
反相 HPLC-UV/DAD 是主含量与有关物质控制的核心方法。色谱柱采用 C18，流动相为乙腈或甲醇与磷酸盐缓冲液，pH 2.8，或加入辛烷磺酸钠等离子对试剂。外标法计算主含量，DAD 全波长扫描判定峰纯度，LC-MS 对杂质进行结构鉴定。梯度洗脱可分离 2-氨基-4-甲基苯甲酸、2-氨基-6-甲基苯甲酸等同分异构体。系统适用性以理论塔板数、拖尾因子和分离度控制。氨基与硅醇基作用导致峰形拖尾，酸性流动相和离子对试剂改善峰形。LC-MS 电喷雾正负切换，定量下限达到 ng/mL 级。
气相色谱法
游离羧基和氨基使直接气相色谱分析困难。硅烷化试剂 BSTFA/TMCS 或酯化-酰化衍生化封闭羧基和氨基，提高挥发性。GC-FID 和 GC-MS 用于衍生化后有关物质筛查。顶空 GC 用于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、甲苯等残留溶剂测定，内标法降低进样误差。衍生化条件保证反应完全和产物稳定，衍生化产物在色谱柱上保持惰性。
滴定法
羧基含量用 NaOH 标准溶液滴定，在乙醇-水介质中以电位法指示终点。反应式：—COOH + NaOH → —COONa + H₂O。氨基含量用非水滴定，冰乙酸中 HClO₄ 滴定，反应式：—NH₂ + HClO₄ → —NH₃⁺ClO₄⁻。电位滴定或结晶紫指示终点。滴定法适用于高纯度原料的含量测定，设备简单，专属性低于色谱法，需与 HPLC 联合使用。滴定度按 C₈H₉NO₂ 计算。
波谱与定量核磁
¹H NMR 定量法以高纯内标物为基准，选择甲基峰 2.2 ppm 或芳香氢 6.5–7.8 ppm。qNMR 无需待测物标准曲线，能区分同分异构体，适合对照品标定。IR 用于官能团鉴别，不承担纯度定量。UV 法建立标准曲线用于快速含量筛查。元素分析测定 C、H、N 比例，验证化学计量。
杂质谱与残留分析
有关物质由 HPLC-UV/MS 控制，重点分离同分异构体及氧化、脱甲基杂质。水分用 Karl Fischer 库仑法测定。残留溶剂用顶空 GC 测定。元素杂质用 ICP-MS 或 ICP-OES 监控 Pd、Cu、Fe、Ni。炽灼残渣和重金属按药典方法测定。纯度分析方案按原料药放行、实验室研究、对照品标定等用途组合。
方法选择与验证
原料药放行采用 HPLC 含量与有关物质、Karl Fischer 水分、顶空 GC 残留溶剂、ICP-MS 元素杂质。实验室研究采用 LC-MS、qNMR、电位滴定。方法验证包含专属性、线性、范围、准确度、精密度、LOD、LOQ 和耐用性。多技术正交验证使纯度结果达到痕量杂质控制水平。