利非西呱的生物活性和实验方法
发布时间：2018-10-22 16:52:21 编辑作者：活性达人
图片：利非西呱结构式
利非西呱是可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）的一氧化氮（NO）非依赖性活化剂和缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的抑制剂。
一、利非西呱的生物活性详解：
1）体外活性
可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）是异二聚体血红素蛋白和主要的NO受体。 利非西呱（YC-1）在β亚基的含血红素结构域附近或直接结合。在不存在CO的情况下，利非西呱（YC-1）以Kd =9-21μM结合，这取决于构建体。在CO存在下，这些值降低至0.6-1.1μM。如预期的那样，利非西呱（YC-1）极大地增强了与异二聚体sGC的CO结合（Kd =1μM）。 利非西呱（YC-1）在不存在NO的情况下刺激sGC 2至4倍，但与CO或NO协同作用以实现数百倍的活化。 利非西呱（YC-1）的结合也可以克服sGC的抑制性磷酸化[1]。 利非西呱（YC-1）是可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）活化剂。将HCC细胞系HepG2，BEL-7402和HCCLM3与索拉非尼和/或利非西呱（YC-1）一起温育72小时。索拉非尼或利非西呱（YC-1）单独以剂量依赖性方式抑制HCC细胞增殖。此外，索拉非尼和利非西呱（YC-1）的组合以剂量依赖性方式显着抑制HCC细胞的增殖。此外，在索拉非尼和利非西呱（YC-1）的ED50剂量下，HepG2的组合指数值（CI）= 0.93，BEL-7402的组合指数值（0.95）和HCCLM3的0.72，表明索拉非尼和利非西呱（YC-1）协同抑制HCC细胞的增殖[2]。
2）体内活性
利非西呱（YC-1）（30或60mg / kg，腹膜内注射）以剂量依赖性方式抑制MDA-MB-468肿瘤生长。还研究了利非西呱（YC-1），YC-1-S的前药制剂在MDA-MB-468荷瘤小鼠中的作用。体内药代动力学分析表明YC-1-S迅速转化为其活性形式。给小鼠施用20,40或80mg / kg YC-1-S p.o. YC-1-S还显示MDA-MB468肿瘤生长的剂量依赖性抑制。 利非西呱（YC-1）和YC-1-S均剂量依赖性地降低肿瘤重量。此外，与载体治疗组相比，利非西呱（YC-1）或YC-1-S不影响小鼠的平均体重[3]。 利非西呱（YC-1）是一种有效的NO-GC激活剂，据报道用Morris水迷宫（MWM）和回避试验检查可以改善啮齿动物的学习行为。 利非西呱（YC-1）通过NO-cGMP-PKG依赖途径增强海马Schafer侧支CA1突触的长时程增强（LTP），并增强杏仁核中LTP的诱导，增加ERK的激活，并增强ERK的表达。脑源性神经营养因子（BDNF）cAMP反应元件结合蛋白（CREB）响应恐惧记忆试验[4]。
二、利非西呱的实验方法：
1）动物实验
小鼠[3]-使用58只雌性nu / nu小鼠（4周龄）。将MDA-MB-468乳腺癌细胞（每只小鼠5×10 6个细胞）悬浮于0.1mL Matrigel溶液（50％v / v Matrigel in PBS）中并接种到裸鼠的乳腺脂肪垫中。当肿瘤块达到100mm 3时，将荷瘤小鼠随机分成组，用于不同利非西呱（YC-1）/ YC-1-S剂量的治疗。小鼠是i.p.注射YC-1（30或60mg / kg）或给予YC-1-S p.o.每3天测量一次肿瘤大小和小鼠体重，并使用以下等式计算肿瘤体积（mm 3）：长度×（宽度）2×0.5。在实验结束时，杀死小鼠并解剖肿瘤结节并称重。对肿瘤组织进行Western印迹。
大鼠[4]-使用4个月大（200-250g）和24个月大（550-600g）雄性Wistar-albino大鼠。 利非西呱（YC-1）在使用前立即制备，并以每100g体重0.1mL的体积腹膜内（i.p.）给药。所有大鼠接受1mg / kg /天的利非西呱（YC-1），持续2周。将DMSO给予4个月大和24个月大的大鼠（每组n = 10）。选择剂量以确定选定的运动活动剂量;测量所有结果。
2）细胞实验
使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）测量细胞增殖测定。 简而言之，将细胞以3×10 3 /孔的浓度在96孔板中培养，温育24小时，并用索拉非尼和/或利非西呱（YC-1）处理。 处理72小时后，向每个孔中加入CCK-8试剂。 使用自动ELISA板读数器在37℃温育2.5小时后在450nm处测量吸光度。 使用Microsoft Excel软件测量由化合物组合产生的任何协同效应，以确定组合指数值（CI> 1：拮抗效应，CI = 1：加性效应，和CT <1：协同效应）[2]。
3）激酶实验
通过将CO从饱和溶液滴定到sGC蛋白中并监测CO结合的Soret吸收带的外观来测量CO解离常数。 在补充有过量连二亚硫酸盐的Ar吹扫缓冲液中制备MssGCβ1（1-380）和BtsGCβ1（1-197）样品。 使用具有改良样品架的Cary 50分光光度计，在用于Ms sGC-β1（1-380）和Ms sGC-NT21的10cm光程比色皿中进行CO结合实验。 使用SigmaPlot [1]中的单一位点饱和配体结合模型绘制在存在和不存在50μM利非西呱（YC-1）的情况下的结合数据。
所述：利非西呱结合到可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的β亚基，在CO存在条件下，Kd 为 0.6-1.1 μM。它的靶点活性为sGC,HIF-1α。
参考文献：
[1]. Purohit R, et al. YC-1 binding to the β subunit of soluble guanylyl cyclase overcomes allosteric inhibition by the α subunit. Biochemistry. 2014 Jan 14;53(1):101-14.
[2]. Kong J, et al. YC-1 enhances the anti-tumor activity of sorafenib through inhibition of signal transducer and activator of tranion 3 (STAT3) in hepatocellular carcinoma. Mol Cancer. 2014 Jan 13;13:7.
[3]. Chang LC, et al. YC-1 inhibits proliferation of breast cancer cells by down-regulating EZH2 expression via activation of c-Cbl and ERK. Br J Pharmacol. 2014 Sep;171(17):4010-25.
[4]. Komsuoglu Celikyurt I, et al. Effects of YC-1 on Learning and Memory Functions of Aged Rats. Med Sci Monit Basic Res. 2014 Aug 21;20:130-7.
一、利非西呱的生物活性详解：
1）体外活性
可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）是异二聚体血红素蛋白和主要的NO受体。 利非西呱（YC-1）在β亚基的含血红素结构域附近或直接结合。在不存在CO的情况下，利非西呱（YC-1）以Kd =9-21μM结合，这取决于构建体。在CO存在下，这些值降低至0.6-1.1μM。如预期的那样，利非西呱（YC-1）极大地增强了与异二聚体sGC的CO结合（Kd =1μM）。 利非西呱（YC-1）在不存在NO的情况下刺激sGC 2至4倍，但与CO或NO协同作用以实现数百倍的活化。 利非西呱（YC-1）的结合也可以克服sGC的抑制性磷酸化[1]。 利非西呱（YC-1）是可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）活化剂。将HCC细胞系HepG2，BEL-7402和HCCLM3与索拉非尼和/或利非西呱（YC-1）一起温育72小时。索拉非尼或利非西呱（YC-1）单独以剂量依赖性方式抑制HCC细胞增殖。此外，索拉非尼和利非西呱（YC-1）的组合以剂量依赖性方式显着抑制HCC细胞的增殖。此外，在索拉非尼和利非西呱（YC-1）的ED50剂量下，HepG2的组合指数值（CI）= 0.93，BEL-7402的组合指数值（0.95）和HCCLM3的0.72，表明索拉非尼和利非西呱（YC-1）协同抑制HCC细胞的增殖[2]。
2）体内活性
利非西呱（YC-1）（30或60mg / kg，腹膜内注射）以剂量依赖性方式抑制MDA-MB-468肿瘤生长。还研究了利非西呱（YC-1），YC-1-S的前药制剂在MDA-MB-468荷瘤小鼠中的作用。体内药代动力学分析表明YC-1-S迅速转化为其活性形式。给小鼠施用20,40或80mg / kg YC-1-S p.o. YC-1-S还显示MDA-MB468肿瘤生长的剂量依赖性抑制。 利非西呱（YC-1）和YC-1-S均剂量依赖性地降低肿瘤重量。此外，与载体治疗组相比，利非西呱（YC-1）或YC-1-S不影响小鼠的平均体重[3]。 利非西呱（YC-1）是一种有效的NO-GC激活剂，据报道用Morris水迷宫（MWM）和回避试验检查可以改善啮齿动物的学习行为。 利非西呱（YC-1）通过NO-cGMP-PKG依赖途径增强海马Schafer侧支CA1突触的长时程增强（LTP），并增强杏仁核中LTP的诱导，增加ERK的激活，并增强ERK的表达。脑源性神经营养因子（BDNF）cAMP反应元件结合蛋白（CREB）响应恐惧记忆试验[4]。
二、利非西呱的实验方法：
1）动物实验
小鼠[3]-使用58只雌性nu / nu小鼠（4周龄）。将MDA-MB-468乳腺癌细胞（每只小鼠5×10 6个细胞）悬浮于0.1mL Matrigel溶液（50％v / v Matrigel in PBS）中并接种到裸鼠的乳腺脂肪垫中。当肿瘤块达到100mm 3时，将荷瘤小鼠随机分成组，用于不同利非西呱（YC-1）/ YC-1-S剂量的治疗。小鼠是i.p.注射YC-1（30或60mg / kg）或给予YC-1-S p.o.每3天测量一次肿瘤大小和小鼠体重，并使用以下等式计算肿瘤体积（mm 3）：长度×（宽度）2×0.5。在实验结束时，杀死小鼠并解剖肿瘤结节并称重。对肿瘤组织进行Western印迹。
大鼠[4]-使用4个月大（200-250g）和24个月大（550-600g）雄性Wistar-albino大鼠。 利非西呱（YC-1）在使用前立即制备，并以每100g体重0.1mL的体积腹膜内（i.p.）给药。所有大鼠接受1mg / kg /天的利非西呱（YC-1），持续2周。将DMSO给予4个月大和24个月大的大鼠（每组n = 10）。选择剂量以确定选定的运动活动剂量;测量所有结果。
2）细胞实验
使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）测量细胞增殖测定。 简而言之，将细胞以3×10 3 /孔的浓度在96孔板中培养，温育24小时，并用索拉非尼和/或利非西呱（YC-1）处理。 处理72小时后，向每个孔中加入CCK-8试剂。 使用自动ELISA板读数器在37℃温育2.5小时后在450nm处测量吸光度。 使用Microsoft Excel软件测量由化合物组合产生的任何协同效应，以确定组合指数值（CI> 1：拮抗效应，CI = 1：加性效应，和CT <1：协同效应）[2]。
3）激酶实验
通过将CO从饱和溶液滴定到sGC蛋白中并监测CO结合的Soret吸收带的外观来测量CO解离常数。 在补充有过量连二亚硫酸盐的Ar吹扫缓冲液中制备MssGCβ1（1-380）和BtsGCβ1（1-197）样品。 使用具有改良样品架的Cary 50分光光度计，在用于Ms sGC-β1（1-380）和Ms sGC-NT21的10cm光程比色皿中进行CO结合实验。 使用SigmaPlot [1]中的单一位点饱和配体结合模型绘制在存在和不存在50μM利非西呱（YC-1）的情况下的结合数据。
所述：利非西呱结合到可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的β亚基，在CO存在条件下，Kd 为 0.6-1.1 μM。它的靶点活性为sGC,HIF-1α。
参考文献：
[1]. Purohit R, et al. YC-1 binding to the β subunit of soluble guanylyl cyclase overcomes allosteric inhibition by the α subunit. Biochemistry. 2014 Jan 14;53(1):101-14.
[2]. Kong J, et al. YC-1 enhances the anti-tumor activity of sorafenib through inhibition of signal transducer and activator of tranion 3 (STAT3) in hepatocellular carcinoma. Mol Cancer. 2014 Jan 13;13:7.
[3]. Chang LC, et al. YC-1 inhibits proliferation of breast cancer cells by down-regulating EZH2 expression via activation of c-Cbl and ERK. Br J Pharmacol. 2014 Sep;171(17):4010-25.
[4]. Komsuoglu Celikyurt I, et al. Effects of YC-1 on Learning and Memory Functions of Aged Rats. Med Sci Monit Basic Res. 2014 Aug 21;20:130-7.
相关化合物：利非西呱
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