伯舒替尼的生物活性和实验方法

伯舒替尼是一种合成的喹诺酮衍生物和双激酶抑制剂，可靶向具有潜在抗肿瘤活性的Abl和Src激酶。 伯舒替尼抑制Abl和Src激酶的自身磷酸化，导致细胞生长和细胞凋亡的抑制。

一、伯舒替尼的生物活性详解：
1）体外活性
伯舒替尼对Src的选择性高于非Src家族激酶，IC50为1.2 nM，有效抑制Src依赖性细胞增殖IC50为100 nM [1]。 伯舒替尼显着抑制Bcr-Abl阳性白血病细胞系KU812，K562和MEG-01的增殖，但不抑制Molt-4，HL-60，Ramos和其他白血病细胞系的增殖，IC50为5 nM，20 nM和20 nM分别比STI-571更有效。与STI-571类似，伯舒替尼对抗Abl-MLV转化的成纤维细胞具有抗增殖活性，IC50为90 nM。 伯舒替尼消除CML细胞中Bcr-Abl和STAT5的酪氨酸磷酸化以及成纤维细胞中表达的v-Abl的浓度分别为~50 nM，10-25 nM和200 nM，导致Lyn的Bcr-Abl下游信号传导抑制/ Hck磷酸化[2]。尽管不能抑制乳腺癌细胞的增殖和存活，伯舒替尼显着降低乳腺癌细胞的运动性和侵袭性，IC50为~250 nM，参与细胞间粘附和β-catenin膜定位的增加[ 3]。

2）体内活性
伯舒替尼（60 mg / kg /天）对裸鼠中的Src转化的成纤维细胞异种移植物和HT29异种移植物具有活性，T / C分别为18％和30％[1]。博索替尼口服给药5天，以剂量依赖的方式显着抑制小鼠K562肿瘤的生长，大剂量肿瘤根除100 mg / kg，150 mg / kg无肿瘤，无明显毒性[2]。由于在50mg / kg每天两次对裸鼠中的Colo205异种移植物无活性，因此对于Colo205异种移植物，每天两次75mg / kg的伯舒替尼剂量是必需的，并且与显着剂量相比，增加伯舒替尼的剂量没有额外益处 - 对HT29异种移植物的依赖性[4]。

二、伯舒替尼的实验方法：
1）动物实验
动物模型：裸体femice注射K562细胞

2）细胞实验
将细胞暴露于各种浓度的伯舒替尼 72小时。 在用Sigmacote处理的96孔超低结合板中测量Abl-MLV转化的成纤维细胞的不依赖于锚定的增殖，以阻断残留的细胞附着。 用MTS或Cell-Glo测量细胞增殖。 为了测定细胞周期或细胞死亡，在CycleTest Plus DNA试剂盒中制备细胞用于FACS分析，并在荧光激活细胞分选仪流式细胞仪上进行分析。

3）激酶实验
以ELISA形式测量Src激酶活性。将Src（3单位/反应），反应缓冲液（50mM Tris-HCl pH 7.5,10mM MgCl 2,0.1mM EGTA，0.5mM Na 3 VO 4）和cdc 2底物肽加入各种浓度的伯舒替尼中，并在30℃温育10小时。分钟。通过加入ATP至终浓度100μM开始反应，在30℃温育1小时并通过加入EDTA终止反应。随后的步骤遵循制造商的说明。 Abl激酶测定在DELFIA固相铕基检测测定形式中进行。将生物素化的肽（2μM）与链霉抗生物素蛋白包被的微量滴定板在PBS中的1mg / mL卵清蛋白中结合1.5小时。用PBS / 0.1％吐温80洗涤平板1小时，然后用PBS洗涤。将激酶反应在30℃温育1小时。将Abl激酶（10单位）与50mM Tris-HCl（pH 7.5），10mM MgCl2,80μMEGTA，100μMATP，0.5mM Na 3 VO 4,1％DMSO，1mM HEPES（pH 7.0），200μg/200μl混合。 mL卵清蛋白和各种浓度的伯舒替尼。用EDTA终止反应，终浓度为50mM。用Eu标记的磷酸酪氨酸抗体和DELFIA增强溶液监测反应。

综上所述：伯舒替尼（SKI-606）是一种新型的双Src / Abl抑制剂，IC50分别为1.2 nM和1 nM。它的靶点活性为Abl,1nM；c-Src,1.2nM；MAPK。

参考文献：
[1]. Boschelli DH, et al. Optimization of 4-phenylamino-3-quinolinecarbonitriles as potent inhibitors of Src kinase activity. J Med Chem, 2001, 44(23), 3965-3977.
[2]. Golas JM, et al. SKI-606, a 4-anilino-3-quinolinecarbonitrile dual inhibitor of Src and Abl kinases, is a potent antiproliferative agent against chronic myelogenous leukemia cells in culture and causes regression of K562 xenografts in nude mice. Cancer Res, 2003, 63(2), 375-381.
[3]. Vultur A, et al. SKI-606 (bosutinib), a novel Src kinase inhibitor, suppresses migration and invasion of human breast cancer cells. Mol Cancer Ther, 2008, 7(5), 1185-1194.
[4]. Golas JM, et al. SKI-606, a Src/Abl inhibitor with in vivo activity in colon tumor xenograft models. Cancer Res, 2005, 65(12), 5358-5364.