| 描述 |
USP7-IN-1 是一种选择性的,可逆的泛素蛋白特异性蛋白酶 (USP7) 抑制剂,IC50 值为 77 μM,可用于癌症研究。
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| 相关类别 |
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| 靶点 |
IC50: 77 μM (USP7)[1]
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| 体外研究 |
USP7-IN-1(实施例2)是USP7的选择性和可逆抑制剂,IC50为77μM,并且对USP8,USP5,Uch-L1,Uch-L3或胱天蛋白酶3没有抑制作用.USP7-IN-1抑制HCT116细胞的增殖,GI50为67μM[1]。
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| 激酶实验 |
USP7在USP缓冲液（50mM Tris HCl; 0.5mM EDTA（乙二胺四乙酸）; 5mM DTT; 0.01％Triton X-100;牛血清白蛋白0.05mg / mL pH7.6）中稀释。将化合物原液（10mM）在-20℃下储存在DMSO中。在不同浓度下测试化合物（包括USP7-IN-1）：从200μM至91nM。反应在Black 384孔板中重复进行（10μL最终反应体积）。 USP7的底物浓度为300nM Ub-AMC。特异性测定中酶（USP7）的浓度为100pM。确定浓度以在固定底物浓度下在初始速度下进行特异性测定。将化合物与酶在25℃下预孵育30分钟。通过向含有在测定缓冲液中稀释的酶（+/-化合物）的平板中加入底物来引发反应。将反应在37℃下温育60分钟。加入乙酸（终浓度100mM）终止反应。读数在Pherastar荧光读数器上进行。 λ发射380 nm; λ激发= 460nm。将数据（平均值+/-标准偏差）分析为对照的％（无化合物），并使用GraphPad绘制为相对于化合物浓度的Log的百分比。数据拟合为S形模型（可变斜率）[1]。
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| 细胞实验 |
将HCT116结肠癌细胞维持在含有10％FBS，3mM谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的Mc Coy 5A培养基中。将细胞在37℃下在含有5％CO 2的潮湿气氛中温育。使用MTS技术在96孔培养板中测定细胞活力。 MTS（3-（4,5-二甲基 - 噻唑-2-基）-5-（3-羧基 - 甲氧基苯基）-2-（4-磺基苯基）-2H-四唑鎓）是MTT衍生的四唑鎓，是将代谢活跃的细胞减少为可溶的，细胞渗透性的甲。通过其在492nm处的吸光度检测的甲amount的量与活的，代谢活性的细胞的数量成比例。每孔接种103个HCT116细胞。 24小时后，更换培养基并将细胞一式三份处理，每种化合物的浓度为100μM至50nM。将化合物（包括USP7-IN-1）在100％DMSO中稀释，其在细胞上的最终浓度保持在0.5％。将细胞与化合物一起温育72小时，然后通过加入MTS测定其存活力2小时。直接从96孔培养板测量492nm处的吸光度。使用S形可变斜率拟合计算每种化合物的GI 50（生长抑制50）浓度。数值代表三次独立实验的平均值[1]。
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| 参考文献 |
[1]. SELECTIVE AND REVERSIBLE INHIBITORS OF UBIQUITIN SPECIFIC PROTEASE 7. WO 2013030218 A1
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