| 体外研究 |
FG 488 DHPE具有pH依赖性荧光发射特性[1]。散装泡囊中酸化监测[1]：1.仪器：Jasco FP6500荧光分光光度计,37℃荧光在λex=508nm处激发,发射在λem=534nm处检测。2.将100µL蛋白质脂质体(磷脂约为60µM)添加到680µL ATP酶缓冲液中,缓冲液中含有K+离子载体缬霉素(5 nM),以实现转运质子的电荷平衡。3.添加ATP(1.2 mM)以诱导质子泵。4.向ATP水解中添加1mM NaN3。5.添加CCCP(羰基氰化物3-氯苯基肼,0.4µM)以耗尽质子梯度。6.转换为pH值,荧光强度标准化为添加ATP后直接获得的强度。FG 488 DHPE在量化电压依赖性质子通道Hv1引起的pH变化方面发挥作用[2]。磷脂浓度的定量[2]：1.向含有OG488-DHPE(30μL)的单层囊泡样品中添加高氯酸(70%,200μL)。2.加热至220°C 60分钟,生成无机磷酸盐。3.冷却至室温,加入700μL NH4MoO4(0.45%(w/v))和高氯酸(12.6%(w/w))溶液,以及700μL 1.7%(w/v)醋酸溶液。4.获得校准曲线,以了解NaH2PO4浓度。5.将样品在80°C下培养10分钟,并在820 nm处测量样品的吸收。6.使用校准曲线计算囊泡的磷脂浓度。质子易位分析[2]：1.仪器：Jasco FP6500荧光分光光度计,37℃荧光在λex=508nm(3nm带宽)激发,发射在λem=534nm(3Nm带宽)检测。2.将由POPC/POPG/Chol/OG488-DHPE(54.5:25:20:0.5)组成的蛋白脂质体在通量缓冲液中的缓冲液A中稀释,在囊泡膜上产生14倍的K+梯度。3.添加缬霉素(13 nM)以引起OG488-DHPE质子化,并在如上所述的Hv1通道活跃的情况下熄灭其荧光强度。4.添加CCCP(6 nM),使质子的所有囊泡渗透。5.将归一化荧光强度Fnorm绘制为时间函数。作为质子泄漏的控制,使用无蛋白囊泡代替蛋白质脂质体。对于存在潜在抑制剂2GBI的实验,将抑制剂(15 mM)溶解在通量缓冲液中,并在添加安定霉素之前向蛋白脂质体添加(0.5-8.0μL)以诱导质子移位。
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