[ 描述 ]:
PF-06751979 是一种有效的,脑渗透性的 β-淀粉样前体蛋白裂解酶1 (BACE1) 抑制剂,IC50 为 7.3 nM。
[ 相关类别 ]:
[ 靶点 ]
IC50: 7.3 nM (BACE1), 194 nM (BACE2)[1]
[体外研究]
相对于文献实例和BACE1程序中的多个化学系列,PF-06751979在结合(27倍)方面显示出优于BACE2的选择性(IC50 = 194nM)。 PF-06751979还在荧光偏振(FP)测定中抑制BACE1和BACE2,IC50分别为26.9nM和238nM。 PF-06751979在BACE1中具有优异的结合或FP测定形式的效力以及观察H4细胞中sAPPβ产生的细胞活性,IC50为5 nM [1]。
[体内研究]
PF-06751979显示出优异的脑渗透性,有效的体内功效,以及相对于相关天冬氨酰蛋白酶(包括BACE2)的广泛选择性。 PF-06751979的急性给药产生强烈的剂量反应性和时间依赖性脑脊液(CSF)Aβx-40的减少,在3小时时峰值抑制> 77％。为了确定在持续暴露于PF-06751979期间是否维持脑和CSFAβ的减少,进行5天亚慢性研究,每天通过皮下(SC)给药(10或50mg/kg /天)给药一次。在最后一次剂量后第5天收集脑和CSF样品。 PF-06751979对小鼠脑中的Aβ42产生剂量反应性和时间依赖性抑制。在50mg/kg /天剂量下,在7至9小时时最大脑降低为63％。施用PF-06751979(10或50mg/kg /天,持续5天)对小鼠CSF中的Aβx-40产生剂量反应性和时间依赖性抑制,导致在最终50mg后3小时对CSF的77％抑制。/kg剂量[1]。
[激酶实验]
借助于优化的合成肽底物生物素-GLTNIKTEEISEISYEVEFR-C [Oregon green] KK-OH测量BACE1和BACE2酶活性。在切割肽底物后，测量荧光偏振的降低。在384孔聚丙烯板中将化合物用100％DMSO中的半对数稀释11倍，顶部浓度为10mM。然后将100％DMSO剂量响应曲线加入到384孔黑色测定板中，每孔0.150μL。最终工作顶部浓度为0.1mM，DMSO浓度为1％。然后在测定缓冲液（100mM乙酸钠，用冰醋酸，0.001％吐温20的pH至4.5）中加入体积为7.5μL的BACE底物。 384孔测定板的第1列中的背景孔接受7.5μL测定缓冲液。除了第1列中的背景孔外，在测定缓冲液中加入7.5μLBACE1或BACE2酶开始反应。肽底物的最终浓度为150nM，BACE1和BACE2酶的终浓度为0.15。和2.5 nM。将测定板密封并在37℃下孵育3或1小时（分别为BACE1或BACE2）。温育后，向所有孔中加入15μL终止溶液（在Dulbecco PBS中1.5μM链霉抗生物素蛋白），并读板。基于不含酶的100％效应对照孔和不含化合物的0％效应对照孔，基于荧光偏振（FP）读数计算每种化合物浓度的百分比效应值。绘制了利用给定化合物的浓度和百分比效应值的曲线拟合分析，并使用S形四参数拟合算法[1]确定IC50。
[细胞实验]
神经胶质瘤细胞系H4细胞在含有10％胎牛血清（FBS）和200mM谷氨酸的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中生长。将细胞在组织培养物处理的Falcon 384孔板中以4500个细胞/孔的细胞密度在50μL培养基中铺板过夜。第二天，除去培养基，用PBS洗涤细胞一次，之后将25μL培养基置于所有孔中，然后加入稀释的PF-06751979剂量反应曲线。测试的最高浓度为30μM，含1％DMSO。用作背景对照的细胞接受30μM的专有化合物。使化合物与细胞在37℃培养箱中孵育过夜。同时，将384孔黑色Nunc Maxisorp平板在4℃下与10μL4μg/mLAβ抗体在包被缓冲液（0.1M碳酸氢钠，pH8.8至9.0）中孵育过夜[1]。
[动物实验]
小鼠[1]雄性129 / sve野生型小鼠（20-25g）在用载体或PF-06751979皮下给药之前使用10mL / kg的给药体积处于非禁食状态。用PF-06751979（10或50mg / kg /天）或载体每天一次皮下给予小鼠一次，持续5天。然后在给药后1,3,5,7,14,20和30小时处死小鼠（每组n = 5）。在心脏穿刺到含乙二胺四乙酸（EDTA）的管中后，收集全血样品（0.5-1.0mL），并通过离心（1500×g，4℃下10分钟）分离血浆。将产生的血浆分配到湿冰上的单独管中，用于暴露测量（50μL）和Aβ分析（剩余）。使用无菌25号针头通过脑池穿刺获得CSF样品（8-12μL）并用P-20 Eppendorff移液管收集。将CSF样品分配到干冰上的单独管中用于暴露测量（3μL）和Aβ分析（剩余）。取出全脑并分成暴露测量值（小脑）和Aβ分析（左半球和右半球），称重并在干冰上冷冻。在测定之前，所有样品都储存在-80°C [1]。
[参考文献]
[相关活性小分子]