AL 082D06

AL 082D06 是一种选择性的非甾体类糖皮质激素受体 (GR) 拮抗剂,Ki 为 210 nM。

信号通路 >> G 蛋白偶联受体/G 蛋白 >> 糖皮质激素受体

研究领域 >> 内分泌

Ki: 210 nM (GR)[1]

AL 082D06(D06)以纳摩尔亲和力特异性结合GR。添加AL 082D06引起MMTV：Luc报告基因的转录激活的剂量依赖性降低,其用半数最大DEX浓度刺激。 AL 082D06使用几种糖皮质激素反应性启动子-报道系统(包括3-kb酪氨酸氨基转移酶(TAT)启动子)和由分离的糖皮质激素反应元件(GRE)序列组成的较不复杂的启动子,起到拮抗报道活性的作用。 AL 082D06与3H-Dex竞争杆状病毒表达的GR具有纳摩尔亲和力。其他细胞内受体(AR,ER,PR和MR)在具有适当受体和氚化配体(> 2500nM)的类似结构的结合测定中对AL 082D06没有亲和力。 AL 082D06对黄体酮,雄激素,盐皮质激素,类视黄醇,糖皮质激素或雌激素受体没有活化功效。 AL 082D06在拮抗GR活性方面非常有效,但与用作对照的参照拮抗剂相比,当针对其他类固醇受体进行测试时表现出更弱的效力[1]。

提取物和结合测定缓冲液由25mM磷酸钠，10mM氟化钾，10mM钼酸钠，10％甘油，1.5mM EDTA，2mM二硫苏糖醇，2mM CHAPS和1mM苯甲基磺酰氟（pH7.4）组成，at室内温度。以这种方式产生的细胞内受体在公开的亲和力下表现出与已知配体的可再现的相互作用。在测定之前对这些制剂进行广泛的质量控制实验，包括受体反应，特异性，大小和参照配体亲和力。进行受体测定，最终体积为250μL，含有50-75μg提取蛋白，加上1-2nM [3H] Dex，84 Ci / mmol和不同浓度的竞争配体（0-10μM）。使用96孔微管系统进行测定，并在4℃下孵育18小时。在这些缓冲液和温度条件下的平衡达到6-8小时。非特异性结合定义为在1000nM未标记的Dex存在下保留的结合。在温育期结束时，将200μL的6.25％羟基磷灰石加入洗涤缓冲液（不含二硫苏糖醇和苯甲基磺酰氟的结合缓冲液）中。通过羟基磷灰石结合测定法测定与受体结合的特异性配体。羟基磷灰石吸收受体 - 配体复合物，允许从游离放射性标记的配体中分离结合物。将混合物涡旋并在4℃温育10分钟并离心，除去上清液。将羟基磷灰石颗粒在洗涤缓冲液中洗涤两次。受体 - 配体复合物的量通过加入来自National Diagnostics的0.5mM EcoScint A闪烁混合物后的羟基磷灰石颗粒的液体闪烁计数来确定[1]。

[1]. Miner JN, et al. A nonsteroidal glucocorticoid receptor antagonist. Mol Endocrinol. 2003 Jan;17(1):117-27.

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