伏立诺他 - 作用 - 生物活性 - 伏立诺他靶点活性

伏立诺他，英文名伏立诺他，CAS号是149647-78-9，它是组蛋白去乙酰化酶抑制剂。伏立诺他是具有抗肿瘤活性的合成异羟肟酸衍生物。这允许异羟肟酸部分螯合位于HDAC催化袋中的锌离子，从而抑制脱乙酰化并导致高乙酰化组蛋白和转录因子的积累。组蛋白的超乙酰化导致细胞周期蛋白依赖性激酶p21的上调，然后G1停滞。非组蛋白蛋白质如肿瘤抑制因子p53，α微管蛋白和热休克蛋白90的超乙酰化产生额外的抗增殖作用。该试剂还诱导细胞凋亡并使肿瘤细胞对细胞死亡过程敏感。伏立诺他穿过血脑屏障。那么它的生物活性是什么？如何做实验呢？下面让小编给您详细说明。

首先我们介绍伏立诺他的生物活性：

1）体外活性
伏立诺他在治疗24小时后已经以低剂量（3μM）有效抑制MES-SA细胞生长。HDAC I类（HDAC2和3）以及II类（HDAC7）优先受这种治疗的影响。伏立诺他显着增加MES-SA细胞中p21WAF1的表达和凋亡[1]。伏立诺他抑制SK-N-SH和SK-N-Be（2）C，IC25值分别为1μM和0.5μM[2]。

伏立诺他对多种肿瘤细胞增殖具有抑制作用（包括多发性骨髓瘤，淋巴瘤，非小细胞肺癌和白血病），IC50为0.5-10μM。伏立诺他剂量依赖性地抑制两种类型细胞增殖。通过比较伏立诺他作用于一组细胞系–正常人非纤维细胞(WI-38)和 SV40巨大T抗原转化WI-38(VA-13细胞)发现，除抑制转化细胞增殖外, 伏立诺他对正常细胞增殖也有抑制作用。但伏立诺他对肿瘤细胞具有选择毒性，使肿瘤细胞死亡，但只抑制正常细胞不会使其死亡。伏立诺他抑制肿瘤细胞生长，包括NB4（IC50：0.7μM）, H460（IC50：3.4 μM） 和HCT-116（IC50：1.2 μM）。

伏立诺他抑制HDAC活性，包括乙酰化组蛋白和非组蛋白的积累，从而抑制培养细胞的增殖和肿瘤生长。和5-aza联用相比，伏立诺他和Genistein联用对细胞死亡的诱导效果要高很多。伏立诺他和Genistein联用可使ARCaP-E增殖降低 80 %，使ARCaP-M细胞增殖降低60 %以上。Genistein和伏立诺他联用对细胞增殖的抑制作用具有协同效应。作用于ARCaP-E 细胞(820个基因 诱导和1046个基因抑制) 和ARCaP-M 细胞时，与Genistein相比伏立诺他影响的基因更多。

作用于肿瘤细胞表面，伏立诺他剂量依赖性提高Fas蛋白水平，且以0.75 μM处理时提高达到一个稳定水平。作用于淋巴瘤和白血病细胞，包括 Burkitt, B-细胞急性淋巴细胞白血病 (B-ALL), MCL, DLBCL, ATL和T-细胞，Vorinosta对细胞增殖有不同程度的抑制作用。

2）体内活性
在注射5×106 MES-SA细胞的裸鼠中，伏立诺他（50 mg / kg /天）可使肿瘤生长减少50％以上[1]。伏立诺他和Decitabinet联用可增强肿瘤衰退的效果。在未处理时，野生型和Fasgld 小鼠中在肺肿瘤负担方面的区别并不明显。但与处理Fasgld小鼠相比，伏立诺他和Decitabinet联用处理野生型小鼠的肿瘤衰退效果要高很多。伏立诺他和Decitabinet使结肠癌细胞对FasL调节的肿瘤衰退敏感。伏立诺他和Decitabinet低剂量处理时无明显肝脏毒性。

我们已经了解了伏立诺他的生物活性，接下来如何做活性实验呢？一般来说，有如下的三种方法：

1）细胞实验
通过使用RIPA缓冲液（25mM Tris-HCl pH 7.6,150mM NaCl，1％NP-40,1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS）制备细胞裂解物，并通过Bio-Rad DC蛋白质测定法测定蛋白质浓度。通过SDS-PAGE分离蛋白质裂解物并转移至硝酸纤维素膜。使用以下抗体和稀释液：兔抗HDAC1（1μg/ mL）; 兔抗HDAC2（1μg/ mL）; 兔抗HDAC3（9μg/ mL）; 兔抗HDAC7（3μg/ mL）; 小鼠抗p21WAF1（0.5μg/ mL）。作为二抗，兔抗小鼠和猪抗兔HRP偶联抗体的终浓度为1μg/ mL。在4℃下过夜孵育用于所有一抗，然后洗涤并在室温下用二抗孵育2小时。通过增强的化学发光测定使特异性蛋白质条带可视化。为了证明蛋白质样品的等量加载，所有蛋白质印迹都被探测β-微管蛋白。

2）动物实验
用异氟醚麻醉12周龄雄性小鼠（n = 14），并将5×106个MES-SA细胞皮下注射到动物的右侧腹中。来自对照组的小鼠接受含有300μL空HOP-β-CD（2-羟丙基-β-环糊精）囊泡的安慰剂。另一组小鼠接受溶解于HOP-β-CD中的伏立诺他，浓度为50mg / kg /天。从注射MES-SA肿瘤细胞后第4天开始腹膜内施用空囊泡和伏立诺他。每周两次估计小鼠体重和肿瘤大小（w2×l×0.52;通过卡尺测量）。将所有小鼠治疗21天，然后通过颈椎脱位处死。将每个肿瘤作为整体分离，并确定不同的肿瘤参数。最后，将肿瘤切片冷冻保存并将福尔马林固定（4％）用于进一步分析。

3）激酶实验
免疫沉淀-HDAC测定：将Jurkat细胞的裂解物在冰上温育1小时，并通过在4℃以12,000g离心10分钟来澄清。将上清液用30μL50％蛋白质G-Sepharose浆液在4℃下预清洗1小时。通过离心沉淀珠粒，并将上清液在4℃下与来自抗HDAC1或HDAC3多克隆抗血清的10μgIgG级分孵育1小时（在室温下与同源或异源免疫肽预孵育2小时）。通过使用与匙孔血蓝蛋白偶联的合成肽，在兔中产生两种抗血清以抵抗HDAC1和HDAC3的羧基末端肽。在4℃下加入30μL50％蛋白质G-Sepharose浆液1小时。通过离心沉淀免疫复合物，并用1mL裂解缓冲液洗涤三次。将珠子重悬于200μLHDAC缓冲液（20mM Tris-HCl，pH 8.0 / 150mM NaCl / 10％甘油）中，并用对应于组蛋白H4的氨基酸1-24的3H-乙酰化肽进行HDAC测定。通过闪烁计数定量释放的[3 H]乙酸。对于抑制研究，将免疫沉淀的复合物与不同浓度的伏立诺他在4℃下预孵育30分钟。

今天介绍了伏立诺他的作用，并且详细地说明了它的生物活性和实验方法。综上所述，伏立诺他Vorinostat是一种有效的，可口服的 HDAC1，HDAC2，HDAC3 (Class I)，HDAC7 (Class II) 和 Class IV (HDAC11) 的抑制剂，对 HDAC1/3 的 ID50 值分别为 10 nM 和 20 nM。它的靶点活性是HDAC,~10nM；HDAC1;HDAC2;HDAC3;HDAC6;HDAC8。

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参考文献：
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