| 描述 |
CC0651 是一种人Cdc34泛素结合酶变构抑制剂。CC0651 有效抑制 p27Kip1的泛素化,IC50 为 1.72 μM。
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| 相关类别 |
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| 靶点 |
IC50: 1.72 μM (p27Kip1 ubiquitination)[1]
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| 体外研究 |
CC0651强烈损害SCFCdc4在底物上泛素链起始的速率,如通过K0遍在蛋白对Sic1的单泛素化所测量的。实际上,CC0651增强了遍在蛋白二聚体和单泛素化hCdc34的形成,与在用CC0651的酯衍生物处理的细胞中观察到的hCdc34缀合物的积累一致。 CC0651完全抑制多聚泛素链的组装并减少游离三聚泛蛋白的形成,并且在较小程度上抑制hCdc34单泛蛋白的形成,但对二泛素的产生没有影响[1]。 CC0651是E2遍在蛋白缀合酶Cdc34A的抑制剂,通过捕获遍在蛋白和E2供体泛素结合位点之间的弱相互作用起作用。使用β-连环蛋白底物肽的定量SCF遍在蛋白化测定对于CC0651抑制产生的IC50值为18±1μM,类似于在NMR和TR-FRET测定中观察到的有效浓度[2]。
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| 激酶实验 |
对于小分子筛选，p27Kip1在与40 nM磷酸-p27,40 nME1,5μME2,25nM SCFSkp2,25 nM Cks1和27.8μM生物素化泛素在40 mM Tris-HCl中的15μL反应中泛素化[pH 7.5]，5mM MgCl 2,1mM DTT和0.5mM ATP，在23℃下保持3小时。用测定稀释剂终止反应，转移到涂有62ng SC528抗体的384孔蛋白A板上，温育1小时，并在加入之前用10mM Tris-HCl [pH 7.6]，0.05％Tween20洗涤6次。每孔中HEPES [pH 7.6]，1％BSA，0.2％吐温20中的25μL0.4mg/ mL铕链霉抗生物素蛋白。将板孵育1小时，洗涤，并在加入25μL增强溶液后读取Eu-时间分辨荧光。对于基于凝胶的泛素化测定，将CC0651及其类似物与指定浓度的0.5μgE1,4-4μghCdc34和50 ng SCFCdc4,100 ng SCFFbw7,150 ngSCFβTrCP或50 ng SCFSkp2预孵育10-45分钟在4℃下，在20μL反应缓冲液（50mM HEPES [pH 7.5]，10mM MgCl 2,2mM ATP和50μMDTT中）。通过加入1μg遍在蛋白和各自的SCF底物（50ng HisSic1被Cln2-Cdc28磷酸化，50ng细胞周期蛋白E被Cdk2磷酸化，25ng生物素化IκBα磷酸肽[KKERLLDDHDpSGLDpSMKDEE]或50ng p27Kip1被细胞周期蛋白E-Cdk2磷酸化）引发反应，在30℃下孵育1-3小时，并通过免疫印迹显示产物[1]。
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| 细胞实验 |
PC-3和HCT116细胞系在补充有青霉素/链霉素，2mM谷氨酰胺和10％胎牛血清（FBS）的DMEM中生长。使用用于人CDC34，UBE2R2和非靶标控制的慢病毒shRNA构建体。对于增殖测定，将PC-3培养物以5000个细胞/孔一式四份接种在24孔板中，生长24小时，然后用慢病毒上清液感染。对于小分子抑制，将细胞以500个细胞/孔接种在96孔板中一式四份，生长24小时，并用化合物处理。通过MTT测定法测量增殖。通过血清饥饿将PC-3或HCT 116培养物在G0 / G1中同步30小时，然后通过添加10％血清释放。对于上位性实验，用CDC34shRNA感染PC-3细胞24小时，然后加入抑制剂并在4天后评估增殖。使用抗Cdc34，抗p27，抗α-微管蛋白，抗泛素和抗细胞周期蛋白E抗体[1]。
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| 参考文献 |
[1]. Ceccarelli DF, et al. An allosteric inhibitor of the human Cdc34 ubiquitin-conjugating enzyme. Cell. 2011 Jun 24;145(7):1075-87. [2]. Huang H, et al. E2 enzyme inhibition by stabilization of a low-affinity interface with ubiquitin. Nat Chem Biol. 2014 Feb;10(2):156-63.
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